苦苣苔科、兰科和芸香科十二种野生植物的超低温保存技术研究

	苦苣苔科、兰科和芸香科十二种野生植物的超低温保存技术研究
	林亮
导师	李唯奇
关键词	超低温保存微滴玻璃化细胞薄层培养苦苣苔科虾脊兰属兰属弥勒苣苔富民枳红河橙蔗糖预培养解冻后渗透处理
摘要	由于人类活动和气候变化，中国的濒危植物在其原生地存在灭绝的风险而需要迁地保护。很多濒危植物由于生产非正常性种子，无法通过常规种子保存技术进行保存。超低温保存是植物种质资源长期保存的重要手段。植物超低温保存技术在农作物种质资源的保存中发挥了重要作用。野生植物，特别是濒危植物的超低温保存研究逐渐成为热点。本文对苦苣苔科、兰科和芸香科共12种野生植物进行了超低温保存技术研究。通过微滴玻璃化法建立了成功的超低温保存方案。中国苦苣苔科植物具有重要的观赏和药用价值。中国苦苣苔科植物大部分种都分布在狭小而生境特化的区域，濒危物种非常多。本文首先研究了分布于云南石灰岩地区的濒危物种弥勒苣苔的超低温保存方案。主要结果如下：1. 通过离体叶片诱导可以得到茎尖。长度约2毫米的离体茎尖用于超低温保存实验。2. 蔗糖预培养的浓度和时间、PVS2处理时间和冷驯处理对超低温保存茎尖的再生率有重要影响。3. 在优化的条件下，超低温保存茎尖的再生率达到86%。优化的超低温保存方案为：（1）茎尖在25℃下以含有0.3M蔗糖的液体MS培养基预培养24小时。（2）在25℃下以loading solution溶液处理20分钟，转入预冷的PVS2在0℃下处理90分钟后转入铝箔条快速插入液氮保存。（3）解冻时，直接将铝箔条从液氮中取出，快速插入10毫升unloading solution 溶液在25℃下处理20分钟。（4）恢复培养的前7天进行暗处理。在后续实验中，借鉴弥勒苣苔超低温保存的经验，以圆叶唇柱苣苔为指示物种，建立了通用性较好的苦苣苔科植物叶圆片超低温保存技术。主要结果如下：1. 以离体叶片制备直径为3毫米的叶圆片，经过不定芽诱导程序可以作为超低温保存的外植体。这种外植体的使用可以为莲座叶状和灌木状两类植株类型的苦苣苔科植物建立通用性的超低温保存程序。2. 使用PVS3作为玻璃化溶液可以得到更为稳定的结果。3. 建立的5种苦苣苔科植物的优化超低温保存方案通用性好。仅在PVS3的处理时间上表现了差异性。4.在优化的方案下，圆叶唇柱苣苔、美丽唇柱苣苔、吊石苣苔、齿叶吊石苣苔和保山吊石苣苔叶圆片超低温保存的再生率分别达到53%、100%、70%、53%和43%。兰科植物的很多物种由于生产短寿命种子而需要进行超低温保存。兰科植物超低温保存的外植体包括未成熟种子、成熟种子、圆球茎、类圆球茎和茎尖等类型。本文开展了剑叶虾脊兰、西藏虎头兰、多花兰和虎头兰茎尖的超低温保存研究。主要结果如下：1. 通过细胞薄层培养技术建立了适合于四种兰科植物的类圆球茎培养体系。以类圆球茎制备厚度约0.6毫米的细胞薄层，接种到添加2%（w/v）蔗糖和0.3%（w/v）活性炭的VW培养基上，经过2个月培养，可以高效诱导下一代类圆球茎。在这个体系下，剑叶虾脊兰、西藏虎头兰、多花兰和虎头兰类圆球茎在2个月内可以分别增殖约15.2、15.0、6.0和16.7倍。2. 以类圆球茎产生的茎尖作为超低温保存的外植体。3. 优化了微滴玻璃化程序中的预培养，PVS2处理和恢复培养程序。4. 在优化条件下，剑叶虾脊兰、西藏虎头兰、多花兰和虎头兰超低温保存茎尖的再生率分别达到了78%、62%、67%和78%。5. 发现了解冻后渗透处理对超低温保存茎尖再生率的重要影响。为超低温保存方案的优化提供了新的方向。芸香科在云南有两个濒危种：富民枳和红河橙。这两个濒危种由于可能生产中间性种子而需要进行超低温保存。另外，这两个种也由于数量稀少，难以获得种子而无法进行种子或胚轴的超低温保存。本文首先以西南野生生物种质资源库离体库长期保存的富民枳试管苗为起始材料，建立了富民枳的组织培养体系。以微滴玻璃化为技术途径，建立了富民枳茎尖的超低温保存体系。结果如下：1. 富民枳茎尖对PVS2处理具有高度耐受，PVS2在0℃下处理10-50分钟对茎尖没有毒害作用。2.微滴玻璃化法和玻璃化法对富民枳茎尖效果类似。3. 在优化的条件下，富民枳超低温保存茎尖的存活率达到90%再生率达到78%。4. 超低温保存茎尖通过恢复培养程序可以重新建立起试管苗。重新建立的试管苗通过生根培养程序可以得到完整植株。完整植株移栽成活率接近100%。以红河橙种子无菌萌发得到的无菌苗为起始材料，建立了红河橙组织培养体系。直接使用富民枳的超低温体系进行了红河橙茎尖的超低温保存研究。发现富民枳超低温保存体系对红河橙茎尖非常适合，红河橙茎尖微滴玻璃化超低温保存后存活率接近90%。本文为上述濒危物种的超低温保存提供了有效的方案。为苦苣苔科、兰科和芸香科植物的超低温保存提供了通用性较好的方案。为在中国西南野生生物种质资源库建立植物超低温保存体系做出了有益探索。
语种	中文
	2014
学位授予单位	中国科学院大学
学位名称	博士
文献类型	学位论文
条目标识符	http://ir.kib.ac.cn/handle/151853/75703
专题	昆明植物所硕博研究生毕业学位论文
推荐引用方式 GB/T 7714	林亮. 苦苣苔科、兰科和芸香科十二种野生植物的超低温保存技术研究[D]. 中国科学院大学,2014.

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201118010615004_16.p（638KB）	学位论文		限制开放	CC BY-NC-SA	请求全文