岩藻糖化糖胺聚糖 系统给药的毒性作用及其相关的血小板激活作用与机制

	岩藻糖化糖胺聚糖系统给药的毒性作用及其相关的血小板激活作用与机制
	林丽莎
导师	赵金华
关键词	岩藻糖化糖胺聚糖，毒性机制，血小板聚集，构效关系，血小板受体 Fucosylated glycosaminoglycan, Toxic effect, Platelet aggregation, Structure-activity relationship, Platelet receptor
摘要	岩藻糖化糖胺聚糖(Fucosylated Glycosaminoglycan, FG)是来源于棘皮动物海参体壁的一类糖胺聚糖衍生物，其具有侧链硫酸化岩藻糖的特殊结构。原型FG是新药研发的先导化合物，其具有广泛的药理学活性，尤其是，通过抑制内源性凝血因子Xase(iXase, FVIIIa-FIXa-PL-Ca2+复合物)具有强效抗凝活性，且通过血浆接触系统(FXII激活)和血小板激活具有相反的促凝活性。化学解聚可消除其激活FXII及血小板的活性，因此适当分子量范围内的低分子量FG(low molecular weight FG, LFG)可选择性抑制iXase，有望成为安全有效的抗凝新药。在前期研究中，我们阐明了FG影响FXII激活的构效关系及机制，并发现原型FG静脉注射可引起大鼠急性低血压和严重的心功能损伤。以过硫酸软骨素(Oversulfated Chondroitin Sulfate, OSCS)为对照的研究结果显示，FG和OSCS毒性作用存在一定的差异，OSCS通过血浆接触系统-激肽释放酶-缓激肽/补体激活途径诱导显著的低血压反应，而原型FG通过非缓激肽途径诱导更严重的急性心血管衰竭，其确切的毒性作用机制仍待阐明。目的：本文研究原型FG和解聚FG系统给药(静脉注射，iv)下的副作用差异，原型FG的体内毒性作用机制，FG诱导血小板聚集的构效关系，原型FG激活血小板的机制及其介导的信号通路。对原型FG的副作用研究可为其结构修饰和安全应用提供基础数据指导。方法： (1) 分别采用全自动膜片钳，心肌细胞，大鼠血管环和大鼠离体心脏灌注在离子通道，细胞，组织和器官水平上初步探究原型FG的毒性靶点。 (2) 分别通过血凝仪，血细胞分析仪，H&E染色分析FG给药后大鼠的凝血功能，血小板计数和心肺组织的影响。 (3) 血小板聚集仪(光学和荧光检测模式)分析FG诱导血小板聚集和释放。 (4) 流式细胞仪分析FG对血小板的激活活性。 (5) 酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)检测FG给药后大鼠血浆的D二聚体水平，及FG诱导血小板释放的血栓烷素A2(TXA2)水平。 (6) 生物膜层干涉法(Biolayer interferometry, BLI)检测FG与蛋白受体的结合及其亲和力。结果： (1) 原型FG的毒性作用机制原型FG对hERG离子通道、心肌细胞、血管张力和大鼠离体心脏均无直接影响。而大鼠静脉注射源于Thelenota ananas(梅花参)原型FG(TaFG)和源于Holothuria fuscopunctata(象牙参)的原型FG(HfFG)后，血浆凝血酶原时间(Prothrombin time, PT)缩短、血循环中的血小板计数降低，尸检及组织病理学分析显示，原型FG静脉给药可引起大鼠肺栓塞。此外，HfFG对大鼠呼吸功能的损伤先于其对心电图影响。联用抗凝剂(比伐卢定)和抗血小板药(坎格雷拉)可完全消除HfFG的致死毒性。LFG无类似体内副作用，与其无显著的体外FXII和血小板激活活性一致。 (2) FG诱导人血小板聚集的构效关系侧链结构不同原型FG均具有强效的诱导人血小板聚集的活性，其中，2,4-二硫酸化岩藻糖(Fuc2S4S)侧链含量较高的FGs具有较强活性。解聚法减小FG分子量或链长可降低其诱导血小板聚集的活性。例如，TaFG及其解聚产物诱导血小板聚集的活性随分子量降低而减弱，分子量< 10 kD的解聚产物活性基本消失。 (3) TaFG诱导血小板激活和释放TaFG诱导血小板聚集过程中伴有致密颗粒释放ADP，后者可诱导二相聚集并放大聚集效应。TaFG诱导人血小板聚集的活性不依赖于血浆成分，且TaFG可激活血小板(增加P-选择素表达水平)。FG激活血小板的活性同样具有分子量依赖性。 (4) TaFG诱导血小板聚集依赖于血小板释放和αIIbβ3 阿司匹林和替卡格雷可抑制FG诱导的血小板二相聚集，而替罗非班可完全抑制，提示TaFG的强效作用依赖于血小板释放反应(ADP，TXA2)及αIIbβ3受体的参与。TaFG可亲和性结合αIIbβ3(KD值为1.27E-08 M)，但在β3敲除小鼠血小板中，β3敲除不能消除FG的激活活性，提示，αIIbβ3并非主要靶点，TaFG可能通过其它受体激活血小板，再经αIIbβ3介导活化血小板的聚集。 (5) TaFG激活血小板的依赖于胞内Src信号通路 TaFG可诱导小鼠血小板聚集、激活及TXA2生成。Src和Syk抑制剂均可显著抑制TaFG诱导的小鼠血小板聚集、激活和释放，而Gq抑制剂无明显影响。提示，TaFG激活血小板的活性由酪氨酸激酶Src依赖的受体而非G蛋白偶联受体介导。 (6) CLEC-2受体对TaFG活化血小板的介导作用 TaFG可高亲和力结合CLEC-2(强于TaFG-αIIbβ3的亲和力)，KD值为6.81E-09 M。FGs与固化TaFG竞争结合CLEC-2的活性与其诱导血小板聚集的活性一致，随分子量减小而减小。此外，CLEC-2受体抑制剂可抑制TaFG诱导血小板聚集的活性。TaFG的直接作用靶点可能为CLEC-2。结论： (1) 尽管原型FGs具有表面激活作用，但其毒性机制不同于OSCS，OSCS通过表面激活-缓激肽/补体系统引起低血压反应，原型FG静脉注射给药后可引起凝血系统及血小板活化导致肺微血管栓塞，继而引发肺功能衰竭、严重低血压和致死性心功能衰竭。LFG无类似副作用。 (2) FGs诱导血小板聚集的活性随分子量减小而减弱，具有Fuc2S4S侧链的FG活性更强；FG可激活血小板通过胞内信号通路诱导血小板聚集，而不是诱导物理性凝集。 (3) 原型FG通过CLEC-2受体-Src-Sky酪氨酸激酶信号通路介导血小板活化和聚集；FG诱导强效的血小板聚集依赖于血小板释放(ADP，TXA2)及αIIbβ3受体的参与。本文通过系统的研究分析发现，原型FG给药下的毒性作用可能主要由血小板活化与表面激活作用共同介导，而其血小板活化作用的主要通过CLEC-2途径实现。; Fucosylated glycosaminoglycan (FG) from the body wall of echinoderm sea cucumber is a special glycosaminoglycan derivative, with the side chains of sulfated fucoses. Natural FG is a leading compound for new drug development, it shows multiple pharmacological activities, particularly, it has both anticoagulant activity by targeting intrinsic coagulation factor tenase (iXase, FVIIIa-FIXa-PL-Ca2+), and procoagulant activity by activating plasma contact system (FXII activation) and platelets. After chemical depolymerization, the obtained low molecular weight FG (LFG) can selectively inhibit iXase, thus it’s a safe and effective anticoagulant candidate. In previous study, we clarified the structure-activity relationship and mechanism of FG in FXII activation, and found that intravenous injection of natural FG can cause acute hypotension and cardiac dysfunction in rats. We used another reported glycosaminoglycan oversulfated chondroitin sulfate (OSCS) as a reference, the results showed that FG and OSCS have different toxic mechanisms. OSCS caused hypotension effect by activating plasma contact system-kinin-bradykinin/complement pathway, while natural FG can cause more severe cardiovascular failure, and the exact toxic mechanism remains unclear. Purpose: In this work, we explore the difference of in vivo side effects between FG and depolymerized FG after systemic administration/intravenous injection (i.v.), the toxic mechanism of natural FG, the structure-activity relationship of FG in inducing platelet aggregation and the mechanism and signaling pathway of FG in platelet activation. The study on the toxic effects of natural FG can provide data in guiding structural modification and safe application. Conclusion: (1) Although natural FG also shows activity in FXII activation, its toxic mechanism is different from OSCS. OSCS caused rat hypotension by plasma contact activation-bradykinin/complement pathway, while intravenous injection of natural FG caused coagulation system and platelets activation, leading to microvascular embolism in lung and the secondary effects of hypotension and cardiac dysfunction. LFG do not show either the in vitro activity or in vivo side effects. (2) The activity of FGs in platelet aggregation is decreased with the decrease of molecular weight, and those with higher Fuc2S4S content show stronger activity. FG can activate platelet through intracellular signaling, instead of mere physical agglutination. (3) Natural FGs may induce platelet activation and aggregation via CLEC-2 receptor-Src-Sky signaling, the potent aggregation required the released ADP and TXA2 and depended on αIIbβ3 receptor.
语种	中文
	2022-05
学位授予单位	中国科学院大学
文献类型	学位论文
条目标识符	http://ir.kib.ac.cn/handle/151853/75202
专题	昆明植物所硕博研究生毕业学位论文
推荐引用方式 GB/T 7714	林丽莎. 岩藻糖化糖胺聚糖系统给药的毒性作用及其相关的血小板激活作用与机制[D]. 中国科学院大学,2022.

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林丽莎-220525 FG系统给药的毒性（5816KB）	学位论文		限制开放	CC BY-NC-SA	请求全文