麻竹组培苗开花相关基因的分离和进化发育生物学研究

	麻竹组培苗开花相关基因的分离和进化发育生物学研究
其他题名	Isolation and evo-devo genetics of in vitro flower development related genes from I)endrocalamus latiflorus (Gramineae: Bambusoideae)
	陈永燕
导师	李德铢
学位专业	植物学
关键词	麻竹组培提前开花 Mads-box基因家族进化发育生物学
摘要	被子植物开花现象的产生是植物界进化过程中的一个划时代事件。花的研究是植物进化、发育和遗传学的核心问题之一。目前的研究主要集中在模式植物如拟南芥、金鱼草、水稻等。竹子开花现象则是植物学界的一个难解之谜。本文以麻竹组培诱导开花的组培苗为材料，首次对竹子的花发育进行了分子生物学水平的研究。对麻竹开花组培苗中分离到的18个MADS-box基因进行T进化发育生物学〔evo-dovo genetics〕研究，主要研究结果如下：1．麻竹组培苗开花的诱导以麻竹种子为起始材料，在含0.2mg／1BA的MS培养基上萌芽，然后转入含2 mg／lBA的MS培养基诱导出芽丛。诱导开花的基本培养基为MS培养基，其中大量元素浓度降为3／4，另有三种有机成分终浓度较标准Ms培养基高，即vBI为sml，vB6为lml，烟酸为lml。在含6m岁IBA的MS培养基中可在较短时间内诱导出小穗，但在含高浓度BA的培养基上诱导的小穗大多发育不良，此时可以降低BA的浓度到3ml，并可适当加入0.5-1m幼的KT和10％的椰乳，以改善花的质量。通过调节Ms培养基中细胞分裂素的浓度，可以灵活调节该组培体系在营养生长和生殖生长之间的转换。对照实验表明，尽管BA和KT都是细胞分裂素，但它们在诱导麻竹开花过程中的作用并不相同。BA促进组培苗向生殖生长转化，而KT则有助于改善花的质量以及诱导组培苗向营养生长逆转。2．麻竹小穗cDNA文库的构建以麻竹各时期的混合小穗为材料，构建了麻竹小穗的cDNA文库。文库滴度达到了106pfu/ml。随机挑取1玉个菌斑的PcR扩增结果表明，cDNA片段长度在800-2200bp之间，大多数在15。。bp左右。说明cDNA文库中的克隆基本都是全长的基因。3．SsH方法分离小穗特异表达基因片段初探为分离麻竹小穗中特异表达的基因，采用SSH方法，以麻竹叶的cDNA为驱动样品（driver），小穗的cDNA为实验样品（tester），获得了可能在小穗中特异表达的三个EST片段。经blast在线分析没有发现GenBank里有和它们相似程度较高的基因存在。对该基因片段的分析需要进行进一步的研究。4．麻竹MADS-box基因的分离以麻竹组培诱导开花的幼嫩小穗为材料，提取其mRNA并逆转录为cDNA。根据水稻的MADS-box基因的保守序列设计了特异引物，采用RACE方法分离到18个MADS-box基因克隆的cDNA全长。对这18个墓因的系统学分析表明，它们可分为明显的五个支，即DIM03支，包括5个克隆；DIM06支，包括7个克隆；DIM07支，包括2个克降：DIM32支，包括2个克隆；DIM19支，包括2个克隆。且各分支的靴带支持率都为万00％。在这五支MADS-box基因中，DIM03支、DIM06支和DIM32支属于AGL2-基因亚族：DIM19支属于SQUA-基因亚族；DIM07支属于AGL6一基因亚族。根据225条植物MADS-box基因序列构建的NJ树，可以判断各分支基因与模式植物MADS-box中功能已知的哪些基因亲缘关系最近，并进一步根据序列相似程度推测其可能的功能。其中，与DIMo3支基因关系最近，同时又有表达模式和功能分析报道的有水稻的osMADss和玉米的zMM6。OsMADs8的转基因实验表明它具有使植物开花时间提前的功能。ZMM6是参与调控玉米小穗数目的一个很重要的功能基因。DIM03与OsMADSS的cDNA序列一致性达到了893％，与ZMM6则达到了79.4％，因此推测DIM03可能是这两个基因在麻竹中的直系同源基因。而与DIMO6支基因关系最近，同时又有表达模式和功能分析报道的有水稻的OsMADSI，玉米的ZMMS和ZMM14。转基因实验表明OsMADSI参与了花诱导和开花时间调控。野生型水稻的小穗一般只长一个花序，但在osmadsl强突变体中，小穗中会长出新的花序。此外，采用反义RNA技术的转基因实验表明ZMMS基因的功能减弱后，会导致每个小穗中小花数目的增加，说明ZMMS基因参与了小穗中小花数目的调控。麻竹的DIM06基因与OsMADSl的cDNA序列一致性达到了83.5％，与ZMMS和ZMM14则分别达到了79.4％和81.2％。因此作者认为DIM06支基因是这三个基因在麻竹中的直系同源基因，很可能也参与调控麻竹的开花时间，或者在小穗的结构形成方面具有重要的功能。与DIMM32支基因在系统树中关系最近且有功能分析报道的基因为水稻的OsMADS5。转基因实验表明OsMADSS也参与了花诱导和开花时间调控。DIM32支与OsMADSS的cDNA序列一致性达到了86.9%。因此作者推测这-支基因是OsMADS5的直系同源基因，很可能也在调控麻竹的开花时间方面具有重要的功能。5. MADS-box基因在植物中的进化结合从麻竹中分离到的MADS-box基因，对植物中MADS-bOx基因的系统发育和进化机理进行了研究。采用225个植物以DS-box基因构建的NJ系统树表明，大致可以分为8个大支，即A．AGL19-支；B．真双子叶SOUA-支；C．AGL15-支；D．单子叶SOUA-支：E．AGLZ-支；E AGL6-支；GAP3/PI-支；H．AG-支。各分支间的关系不清楚，呈平行关系。该结果和Johansen et al（2002）基本一致。为探讨SQUA-类、AGL2-类和AGL6类基因之间的关系，我们用三类基因的序列构建了J系统树，但它们之间依然是平行的关系，因此后来的分析中还是将这三类基因分开来进行。基于NJ树对SQUA-类、AGL2和AGL6-类基因的相对速率检测结果表明，单子叶植物SQUA-支和真双子叶植物SQUAA-支之间存在极显著差异。为证明这种差异是否为真差异，根据推导的氰基酸排序后的矩阵，对cDNA序列矩阵中对应于氨基酸矩阵中的gaP的核甘酸删除后，再次检测两支间的相对-速率，结果仍然存在极显著差异。目结果表明真双子叶植物SQUA-支基因的相对进化速率显著高于单子叶植物支。为探讨植物中SQUA-类基因的进化机理，采用似然比检验方法和PAML软件中的branch模型，对单子叶植物和真双子叶植物最近共同祖先中的SQUA基因发生基因重复后，分别在环境的选择压力下形成的适应性进化机理进行了分析。结果表明，sQUA-基因发生基因重复后，在真双子叶植物中的非同义置换的比例较在单子叶植物中高。为进一步检测真双子叶植物祖先谱系中影响单个位点的正选择，我们对同一套数据用队ML软件里的branch-site模型进行了分析。在该模型下的参数估计结果表明，真双子叶SQUA一支的ω＝1.16，基因中28.5％的密码子处于正选择。比较branch-site模型和site-specific模型的似然比检验26InL＝198.65。说明branch-site模型显然是更符合的。因此，似然比检验为正选择压力导致真双子叶植物SQUA支基因的高度分化提供了有力的证据。单子叶植物花被的分化程度远较真双子叶植物低。SQUA-基因属于花发育ABc模型中的A类基因，单独决定花尊的形成，也参与决定花瓣的形成。本文所获得的真双子叶植物SQUA-类基因进化速率远远高于单子叶植物SQUA-类基因，以及似然比检验结果都为单子叶植物在第一轮花器官的分化程度上远远低于真双子叶植物提供了新的分子进化生物学的证据。
语种	中文
	2003
学位授予单位	中国科学院昆明植物研究所
文献类型	学位论文
条目标识符	http://ir.kib.ac.cn/handle/151853/660
专题	昆明植物所硕博研究生毕业学位论文
推荐引用方式 GB/T 7714	陈永燕. 麻竹组培苗开花相关基因的分离和进化发育生物学研究[D]. 中国科学院昆明植物研究所. 中国科学院昆明植物研究所,2003.

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