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题名: 太子参环肽B生物合成及伏马菌素抗性机制初探 
作者: 许文彦
学位类别: 博士
答辩日期: 2011-05
授予单位: 中国科学院研究生院
导师: 谭宁华 ; 杜良成
关键词: 太子参 ; 太子参环肽B ; 植物组织培养 ; 生物合成 ; 放射性同位素饲喂 ; 伏马菌素 ; 自我保护机制 ; 基因敲除
中文摘要: 本论文分为两部分,即太子参环肽B(Heterophyllin B, HB)生物合成研究和伏马菌素(Fumonisins)抗性机制研究。植物环肽(Plant Cyclopeptides)是一类由植物中分离得到的由2-37 个氨基酸(包括蛋白质氨基酸和非蛋白质氨基酸)组成的环状化合物,根据其结构特征及植物来源分为八个类型。植物环肽广泛存在于全球多种植物的根、茎、叶及种子中,大多具有良好的生物活性。HB 在2010年版《中华人民共和国药典》中被收录为中药太子参的质量控制成分。目前植物环肽的生物合成研究鲜见报道,仅有贾爱群博士于2006 年报道的粗酶活性。对植物环肽生物合成途径进行研究将有助于开发利用这类活性分子。伏马菌素是一类由镰孢菌属(Fusarium)真菌产生的真菌毒素(Mycotoxins),可以导致农作物生物量损失并诱发多种畜牧业疾病及人类疾病。研究伏马菌素产生菌的自我保护机制有助于减轻该毒素的危害。第一部分含三章,在对现有环肽生物合成研究进行文献调研的基础上,对未见报道的七类植物环肽生物合成途径进行了推导,并开展了HB 的含量研究和酶活性研究。发现太子参植物材料中HB 的含量为14.8-494.5 μg/g 干重。HB 在萌发期含量较低并进一步降低,在花期和果期含量迅速上升并保持于较高水平,在休眠期含量基本稳定于中等水平。而后建立了大量积累HB 的太子参人工培养体系,发现太子参丛生芽在含0.8 mg/L 萘乙酸、0.5 mg/L 吲哚丁酸和0.2 mg/L6-苄基氨基嘌呤的MS 固体培养基中积累HB 的效果明显,达到850.3 μg/g 干重。体外活性方面,在细胞破碎提取物中主要检测到巯酯键水解活性,同时也检测到微弱的环化活性。体内活性方面,发现饲喂的14C 标记L-型脯氨酸被植物利用并合成HB。研究表明HB 的合成受植物激素调控,同时初步确定HB 的合成部位为细胞浆,为进一步研究奠定了基础。第二部分含一章,开展了合成伏马菌素的真菌Fusarium verticillioides 自身对伏马菌素的抗性机理研究。结果提示FUM17 和FUM18 可能为神经酰胺合成酶并有助于F. verticillioides 对伏马菌素的自我保护,同时F. verticillioides 还存在如FUM16 和FUM19 等其它抗性基因,可能具有多种机制防止伏马菌素的毒害。以上结果为减轻伏马菌素的毒害作用提供了一定信息。各章具体内容如下:第一部分 太子参环肽B 生物合成研究初探根据结构特征及植物来源,植物环肽分为杂环肽和均环肽两大类,并细可分为环肽生物碱、缩酚酸环肽、茄科类型环肽、荨麻科类型环肽、菊科类型环肽、石竹科类型环肽、茜草科类型环肽和环蛋白八个类型。除环蛋白已被证实为基因编码产物外,其它类型的生物合成途径尚未见报道。由于对植物环肽的生物合成途径及机理研究较少,利用细胞工程技术大量合成植物环肽缺乏相应基础。而化学合成又面临环境毒性、工艺复杂、副产物多等困难。植物环肽的利用价值尚未得到充分发掘。微生物环肽与海洋环肽生物合成研究表明除基因编码的核糖体途径外,通过非核糖体途径亦可合成环肽分子。太子参环肽B 属于均环肽大类石竹科类型植物环肽(类型VI),由八个L-型编码氨基酸组成,是太子参的主要特征成份。2006 年贾爱群博士首次报道了太子参粗酶提取物将人工直链肽环化成太子参环肽B 的酶活性。基于以上实验基础,本研究以太子参环肽B 为对象,系统开展了生物合成研究,为进一步探讨植物环肽生物合成机理奠定了基础。第一章 环肽生物合成研究进展及各类型植物环肽生物合成途径推导——首先总结了环肽生物合成的两条途径——非核糖体途径和核糖体途径的组成、催化特点及相关案例,特别对组装完成的肽链的释放机制及环肽的核糖体合成途径的研究进展进行了总结。其次在总结文献资料的基础上,首次根据各类型植物环肽的结构特征,对各自的生物合成途径进行了分析。根据推导,环肽生物碱、缩酚酸环肽、菊科类型环肽和茜草科类型环肽可能为非核糖体途径产物;茄科类型环肽、荨麻科类型环肽和石竹科类型环肽可能为核糖体途径产物。本章为以太子参环肽B 环化机理为切入口开展植物环肽的生物合成研究提供了指导与帮助。第二章 太子参组织培养及太子参生物材料中太子参环肽B 的含量测定——运用植物化学和高效液相色谱分析等技术,对贵州出产的太子参在一个完整生长周期中各生长阶段的太子参环肽B 含量进行了跟踪分析,发现太子参中太子参环肽B 的含量在14.8-494.5 μg/g 干重之间。而且太子参环肽B 含量在太子参的生长周期中明显存在消耗、积累和储存三个阶段。在太子参的萌发期,太子参环肽B 含量为14.8-102.3 μg/g 干重并呈下降趋势,是消耗阶段;在花期和果期,太子参环肽B 含量迅速上升并保持于238.0-494.5 μg/g 干重的较高水平,是积累阶段;在休眠期,太子参环肽B 含量基本稳定在88.5-207.1 μg/g 干重,是储存阶段。从而证实太子参环肽B 为植物次生代谢产物,为之前提出的植物环肽属植物次生代谢产物的假说提供了实验依据。该研究发现了太子参环肽B 在植物材料中的合成与积累规律,为选取旺盛合成太子参环肽B 的植物材料进一步进行组织培养和酶活性研究提供了依据。运用植物组织培养、植物化学及高效液相色谱技术,建立了可以有效提高组织培养材料中太子参环肽B 含量的培养方法,并初步探讨了不同激素对组织培养材料的生物量增加和太子参环肽B 积累的影响。发现2,4-二氯苯氧乙酸可以明显减少太子参丛生芽鲜重,但对干重的影响不明显;6-苄基氨基嘌呤可以显著增加太子参丛生芽鲜重,也可以增加丛生芽干重;2,4-二氯苯氧乙酸、脱落酸和6-苄基氨基嘌呤均能增加太子参环肽B 在组织培养丛生芽中的积累,其中脱落酸和6-苄基氨基嘌呤的增加效果更为明显;含0.8 mg/L 萘乙酸、0.5 mg/L 吲哚丁酸和0.2 mg/L6-苄基氨基嘌呤的MS 固体培养基对太子参丛生芽中太子参环肽B 的积累效果明显,达到850 μg/g 干重或255 μg/瓶,远高于新鲜太子参和药材中的含量(<500 μg/g 干重)。此外,在研究中第一次发现,经由液体培养的太子参的不定根和培养液上清中均存在太子参环肽B。该研究建立了太子参环肽B的高产体系,为进一步开展酶活性研究提供了稳定的研究材料。第三章 太子参环肽B 体内体外生物合成研究——运用植物组织培养、植物蛋白提取和活性检测、放射性同位素饲喂、植物总环肽薄层层析及放射自显影分析等生物学、生物化学和植物化学技术,从体内、体外两个方面对太子参环肽B的生物合成开展了初步研究。在体内活性方面,发现由14C 标记的脯氨酸被植物利用来合成太子参环肽B,并对比研究不同处理条件下带放射性14C 标记的太子参环肽B 合成量,发现在干燥过程中不可能产生太子参环肽B。在体外活性方面,发现细胞破碎提取物具有水解巯酯键的酶活性和甘油取代活性,和微弱的环化活性。根据实验结果推测,太子参环肽B 系通过非核糖体途径合成的可能性较小,它更可能是通过核糖体途径组装成更大的前体肽后经剪切修饰环合而成,其中可以将直链肽前体环化合成环肽的酶可能存在于可溶性蛋白中。该研究建立了太子参环肽B 生物合成研究体系,并初步确定太子参环肽B 的合成部位为细胞浆。第二部分 伏马菌素抗性机理研究:伏马菌素是神经酰胺生物合成途径中的关键酶——神经鞘氨醇N-酰基转移酶(又称神经酰胺合酶,Sphingonine N-acyl Transferase or Ceramind Synthase)的天然抑制剂,干扰真核生物神经酰胺的生物合成,从而对真核生物产生毒害。伏马菌素可以导致真核生物细胞信号传导紊乱、细胞代谢失调、组织生长受阻,并最终降低农作物生物量积累;以伏马菌素污染的农作物为饲料喂养牲畜可以诱发多种畜牧业疾病,如马中枢神经、肝脏及心脏疾病,又如猪肠道感染。伏马菌素也可诱发类似的人类疾病。镰孢菌属于真核生物,应当受到自身产生的伏马菌素的毒害;但事实上镰孢菌自身生长并未受到影响,说明镰孢菌细胞中存在一定的抗性机制,可以进行自我保护,免受伏马菌素的有害影响。研究镰孢菌细胞的自我保护机制,将有助于消除伏马菌素污染对种植业和畜牧业所造成的不良影响,保护人体健康。第四章 Fusarium verticillioides 中FUM11/16/17/18/19 五个基因在伏马菌素抗性机制中的作用——在伏马菌素生物合成基因簇中,FUM17 和FUM18 与神经酰胺合酶基因高度同源,FUM19 与ABC(ATP-binding cassette)载体蛋白基因高度同源,FUM16 是乙酰-辅酶A 合成酶的同源基因。FUM11 序列与三羧酸转移载体蛋白基因有同源性。以上基因与其它已知伏马菌素生物合成基因紧密连锁并共表达。本部分研究的目的在于寻找以上基因参与拮抗伏马菌素毒性的证据。运用微生物培养、细胞总脂提取、高效液相色谱分析、分子克隆、真菌原生质体制备和DNA 转化等分子生物学、天然产物分析技术,在相应基因敲除突变株的基础上,进行了包括突变株神经酰胺的代谢分析和进一步敲除疑似抗性基因的研究。结果提示,FUM17 和FUM18 可能为神经酰胺合酶;FUM16 和FUM19 可能是抗性冗余基因;在F. verticillioides 基因组中可能存在其它抗性基因。该研究初步阐明F. verticillioides 存在除过量表达神经酰胺合酶和跨膜转移载体以外还存在其它多种机制保护自身免受伏马菌素的毒害。
语种: 中文
内容类型: 学位论文
URI标识: http://ir.kib.ac.cn/handle/151853/16959
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