立体异构酶MarH结构与功能研究

	立体异构酶MarH结构与功能研究
	刘彬
导师	胡凯锋
关键词	Marh Β-甲基异构晶体衍射 Nmr Filterd-noe
摘要	具有不同空间构型的氨基酸的多种衍生物是重要的天然产物生物合成元件。在生物学中，差向异构化反应是产生空间多样性的一种重要途径。比如，(2S,3S)-β-甲基色氨酸（(2S,3S)-β-MeTrp）是Maremycins A和B (MARs)，FR900452, lavendamycin和链黑菌素（Streptonigrin）的重要组成部分，而chaetoglobosin K和indolmycin则含有(2S,3R)-β-甲基色氨酸 ( (2S,3R)-β-MeTrp) 组成单元。从化学合成角度讲，实现β-甲基化氨基酸的β位的构型翻转十分困难，一般体外合成特定构型的β-甲基氨基酸需要耗费数天的时间。在生物体内是如何实现生成两种不同构型的β甲基氨基酸无疑有助于丰富现有的生物合成理论，扩展天然产物合成方法体系。MarH是在研究Maremycins合成途径中发现的MarG-MarH-MarI催化三联体中的一个生物酶。其中MarG是一种氨基转移酶，MarI是碳甲基转移酶，而MarH则是功能未知的cupin家族蛋白。通过体外酶活实验，即在MarG-MarI 共同作用时，可催化L-Trp特异性生成 (2S,3R)-β-MeTrp, 而MarG-MarI和MarH共同作用时，可催化L-Trp特异性生成 (2S, 3S)-β-MeTrp，确定了MarH的有无是决定能否生成(2S, 3S)-β-MeTrp的关键酶。进一步的深入研究确定了MarH主要实现催化(3R)-β-甲基吲哚丙酮酸 ((3R)-β-MeInPy) 立体结构反转形成 (3S)-β-甲基吲哚丙酮酸（(3S)-β-MeInPy）。然而通过一系列的突变实验和同位素掺入整合实验始终无法揭示MarH的催化机制。本文在前人生化研究工作的基础上，首先尝试通过核磁共振分析蛋白稳定性。发现MarH全长蛋白性质不稳定，易降解，无法直接通过核磁共振技术或晶体衍射技术得到较好的结构。通过一系列实验确定了影响其稳定性的因素，包括ICP-MS确定金属离子，酶消化及自然降解寻找稳定存在结构区段等。最终优化得到可以稳定存在的蛋白样品，并通过精细分离纯化使其纯度达到95%以上。首先使用核磁共振技术解析优化后的MarH蛋白与底物类似物L-Trp的复合物结构，通过采集HNCA, CBCA(CO)NH和HNCACB图谱进行复合物的主链归属，然而最终只能实现不到90%主链归属，无法继续计算结构。然后我们使用核磁共振技术解析无底物状态下的MarH（free-MarH）结构，并同时合作使用晶体衍射技术解析MarH蛋白free状态下和结合底物类似物L-Trp的复合物晶体结构。通过核磁共振技术对free-MarH样品采集HNCA，CBCA(CO)NH和HNCACB图谱，完成了MarH蛋白98%的主链HN归属和100%的CA,CB归属，并随后使用HBHA(CO)NH，H(C)CH-TOCSY，CCH-TOCSY完成了97.8% HA, 95.8% HB, 95.1 %HG, 87.9% HD和100% HE归属。但由于同时晶体结构解析成功，没有再继续进行结构计算。虽然晶体解析得到了free-MarH的三维结构，但始终无法获得与底物类似物L-Trp的复合物结构，通过已有的核磁归属数据预测MarH在结合底物前后的二级结构元件组成形式与Free-MarH晶体结构基本一致，同时不同状态下得到的晶体结构显示MarH在多种不同条件下结构无明显差异，说明MarH核心结构非常稳定，不因外源分子发生构象变化。基于此，我们通过已有的晶体结构和已归属核磁数据的基础上，结合核磁共振filtered-NOE技术采集MarH与底物类似物L-Trp之间的NOE信号转换为距离约束，利用Xplor-NIH在多种相互作用力条件下计算得到MarH与L-Trp的复合物结构，其中能量最低的20个结构中重原子的RMSD约为1.0 ?。基于复合物结构分析和突变实验验证，确定了His25是MarH催化异构化反应过程中作为质子受体的碱基。然而在底物有效作用力空间内无法发现可以作为质子供体的酸，因此我们假设异构化反应中的质子供体来源于水分子。从底物对面作为质子供体的水分子参与反应可以很好的解释为什么反应是立体特异性的。MarH的催化机制研究为将来针对MarH的定向改造提供了很好的理论依据。
语种	中文
	2020
学位授予单位	中国科学院大学
学位名称	博士
文献类型	学位论文
条目标识符	http://ir.kib.ac.cn/handle/151853/75693
专题	昆明植物所硕博研究生毕业学位论文
推荐引用方式 GB/T 7714	刘彬. 立体异构酶MarH结构与功能研究[D]. 中国科学院大学,2020.

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201418010615025.pdf（7595KB）	学位论文		限制开放	CC BY-NC-SA	请求全文