转录因子MYC2 调控玉米抗虫响应的机制研究

	转录因子MYC2 调控玉米抗虫响应的机制研究
	马灿容
导师	吴建强
关键词	丁布，茉莉酸，玉米，MYC2，挥发性萜烯化合物 Benzoxazinoids, Jasmonic acid, Maize, MYC2, Volatile terpenes
摘要	植物在与害虫长期共进化的过程中具备了复杂的防御机制。按照作用方式的不同，可分为直接防御和间接防御。直接防御是指植物合成具有毒性、趋避性或者抑制消化能力的抗虫化合物（如烟草属的尼古丁和玉米中的丁布类化合物）来阻止昆虫的取食；间接防御使指植物释放挥发性气体（如萜烯类挥发物、吲哚）吸引害虫的天敌如捕食者、寄生蜂对害虫捕食、寄生。玉米是重要的粮食作物，对我国粮食安全具有举足轻重的战略作用，而虫害严重影响玉米的产量和品质。充分了解和认识玉米与昆虫互作的分子机制，能够为制定新的害虫防治策略以及培育抗虫玉米品系提供重要的理论基础。茉莉酸（Jasmonic acid，JA）是重要的抗虫相关植物激素，而MYC2是JA信号转导途径中关键的转录因子，调控JA介导的防御响应基因的转录表达。在拟南芥、番茄和水稻中，MYC2调控JA介导的抗虫防御机制被广泛研究，但玉米MYC2是否参与调控抗虫防御响应，其调控JA介导的防御响应的分子机理仍然不清楚。本文通过遗传学、生物化学、分子生物学和生物信息学方法对玉米MYC2调控JA介导的玉米抗虫分子机制进行了深入研究，获得以下几个重要结论： 1）ZmMYC2s调控玉米的抗虫防御响应与雄穗发育通过对基因家族进行建树，结合物种演化关系鉴定出了玉米中两个MYC2同源蛋白（ZmMYC2a和ZmMYC2b）。基因的组织特异性表达分析结果表明，ZmMYC2a在幼嫩雌穗和叶片中具有最高的表达量，ZmMYC2b在幼嫩雄穗和叶片中的表达最高。ZmMYC2s的基因表达水平在模拟粘虫取食处理后的叶片中显著增加，说明ZmMYC2s参与调控玉米的抗虫响应。CRISPR/Cas9技术基因编辑玉米自交系KN5585的两个ZmMYC2s基因，获得ZmMYC2s功能丧失的双突变体（命名为myc2ab）和相应的单突变体（命名为myc2a和myc2b）。双突变体myc2ab植株具有雌性化的雄穗表型，而单突变体myc2a和myc2b植株的雄穗发育正常，说明ZmMYC2a和ZmMYC2b共同调控雄穗的性别决定过程。ZmMYC2s突变体对粘虫（Mythimna separata）和草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）的生物测定实验结果表明ZmMYC2a和ZmMYC2b共同正调控玉米对粘虫和草地贪夜蛾的抗性。模拟粘虫取食（Wounding+Oral secretion，W+OS）处理的野生型（wild-type，WT）和myc2ab植株的转录组数据分析表明，ZmMYC2s调控多个昆虫取食诱导的抗虫化合物（如丁布和挥发性萜烯）合成基因的表达。 2）ZmMYC2s正调控模拟粘虫取食和MeJA处理下丁布化合物的生物合成通过对W+OS和茉莉酸甲酯（Methyl-jasmonic acid，MeJA）处理下的WT、myc2ab、myc2a和myc2b植株进行丁布类化合物含量的测定，以及丁布合成基因转录表达的分析发现：ZmMYC2s正调控indole、HDMBOA-Glc、DIM2BOA-Glc、HDM2BOA-Glc、HM2BOA-Glc和MBOA的积累和所有丁布合成基因（除IGPS2）的转录表达。双荧光素酶活性实验发现，ZmMYC2s激活丁布合成基因IGPS1/3和BX10/11/12/14的转录活性，抑制BX1/3/5的转录活性，对BX2/4/6/8/9/13无转录激活/抑制作用。结合三种长度的启动子的转录激活实验和ChIP-qPCR实验表明ZmMYC2s结合IGPS1/3和BX10/11/12/14的0.5-kb长的启动子来激活其转录活性。以上结果说明： ZmMYC2s通过正向调节丁布合成基因IGPS1/3和BX10/11/12/14的转录表达来调控丁布类化合物的积累。 3）ZmMYC2s正调控模拟粘虫取食和MeJA处理下挥发性萜烯化合物的生物合成通过对W+OS和MeJA处理下的WT、myc2ab、myc2a和myc2b植株进行挥发性萜烯化合物含量的测定和萜烯合成基因的转录表达分析发现：ZmMYC2s正调控挥发性萜烯混合物如芳樟醇、(E)-α-佛手柑烯、(E)-β-法呢烯、(E)-橙花叔醇、(E)-3,8-二甲基-1,3,7-壬三烯（(E)-3,8-dimethyl-1,4,7-nonatriene，DMNT）和(E,E)-4,8,12-三甲基-1,3,7,11-十三碳四烯（(E,E)-4,8,12-trimethyltrideca-1,3,7,11-tetraene，TMTT）的释放和萜烯合成基因TPS2/3/5/8/10以及CYP92C5的转录表达。双荧光素酶活性实验表明ZmMYC2s激活TPS2/3/4/5/8/10的转录活性。结合三种长度的启动子的转录激活实验和ChIP-qPCR实验表明ZmMYC2s结合TPS2/3/4/5/8/10的0.5-kb长的启动子来激活其转录活性。因此，ZmMYC2s通过调节萜烯合成基因TPS2/3/5/8/10的转录表达来释放芳樟醇、(E)-α-佛手柑烯、(E)-β-法呢烯、(E)-橙花叔醇、DMNT和TMTT组成的挥发性萜烯混合物。这部分研究说明ZmMYC2s对调控间接防御物质，挥发性萜烯，具有重要的作用。 4）ZmMYC2s调节下游转录因子来调控玉米的抗虫防御响应通过对MeJA处理下的WT和myc2ab植株的转录组数据分析发现，ZmMYC2s调控53%的JA响应基因；结合模拟粘虫取食处理下的WT和myc2ab植株的转录组数据进行韦恩图分析，发现24个ZmMYC2s调控的转录因子对W+OS和JA处理都存在转录水平的响应。双荧光素酶活性实验发现ZmMYC2s激活两个转录因子基因EREB57和bHLH108启动子的转录活性。随机挑选7个转录因子（bHLH108/109/116、EREB57、WRKY53、MYB118和MYBR55）在玉米原生质体中进行丁布合成调控的功能验证发现，在玉米原生质体中过表达bHLH108/109/116、EREB57、WRKY53、MYB118和MYBR55基因促进丁布类化合物的积累，qPCR数据表明这些转录因子促进丁布合成基因BX2/4/6/7/8/13的转录表达。因此，ZmMYC2s可能通过调控下游转录因子，如EREB57和bHLH108等，来调节丁布合成基因BX2/4/6/7/8/13的转录水平，进而调控丁布类物质的合成。综上所述，本论文系统地研究了模拟粘虫取食和MeJA处理下，ZmMYC2s对玉米的丁布类物质和挥发性萜烯化合物的生物合成调控的分子机制，同时挖掘到了7个ZmMYC2s下游的抗虫防御响应转录因子，揭示了ZmMYC2调控的JA介导的玉米抗虫次生代谢物合成的调控机制。本论文的研究完善了单子叶植物中的抗虫防御机制研究，同时也为农业上创制新型抗虫玉米品系提供新视角。; Plants have evolved sophisticated defense mechanisms in the process of long-term coevolution with insects, which can be classified into direct defenses and indirect defenses according to the different modes of action. Direct defenses refer to the toxic, deterrent, or anti-digestive insect-resistant compounds (such as nicotine in Nicotiana and benzoxazinoids in maize) and the indirect defenses are the volatiles (e.g., terpenes, indole) released by plants, which attract the natural enemies of insect herbivores, such as carnivorous predators and parasitic wasps, which can prey on or parasitize the herbivores. Maize is an important grain crop in China, and plays a decisive strategic role in Chinese food security. However, insect pests seriously affect the yield and quality of maize. Fully understanding the underlying molecular mechanism of maize and insect interactions provides an important basis for new maize pest control strategies and for breeding anti-insect maize cultivars. As an important plant hormone, jasmonic acid (JA) plays an important role in the plant’s anti-insect defense response and MYC2 is a key transcription factor in the JA signal transduction pathway. Although the regulatory mechanisms of JA-mediated insect-resistant defense response regulated by MYC2 have been extensively studied in Arabidopsis, tomato, and rice, the molecular mechanism by which maize MYC2s are involved in regulating the JA-mediated insect-resistant defense response is still unclear. In this dissertation, the following important conclusions are obtained through genetic, biochemical, molecular biological, and bioinformatic analyses on the molecular mechanism of maize MYC2s regulation of JA-mediated insect resistance in maize: 1) ZmMYC2s regulate the insect resistance response and tassel development in maize Two maize MYC2 proteins (ZmMYC2a and ZmMYC2b) were identified by building a gene family in conjunction with species evolutionary relationships. The results of tissue-specific expression analysis of these two genes indicated that ZmMYC2a had the highest expression in the ears and leaves, while ZmMYC2b showed the highest levels of expression in the tassels and leaves. The gene expression levels of ZmMYC2a and ZmMYC2b in leaves were significantly increased after simulated insect feeding, suggesting that ZmMYC2s are involved in regulating the insect-resistant defense response in maize. Both ZmMYC2a and ZmMYC2b in the maize inbred line KN5585 were knocked out using CRISPR/Cas9 gene editing technology to obtain double mutants of the loss-of functions of ZmMYC2a and ZmMYC2b (myc2ab) and the corresponding single mutants of ZmMYC2a or ZmMYC2b (myc2a and myc2b). Feminized tassels appeared on the myc2ab mutants, while the tassels of myc2a or myc2b mutants were normal, indicating that ZmMYC2a and ZmMYC2b together regulate the sex determination process in the tassel. The results of bioassay experiments on Mythimna separata and Spodoptera frugiperda indicated that ZmMYC2s ad
语种	中文
	2022-11
学位授予单位	中国科学院大学
文献类型	学位论文
条目标识符	http://ir.kib.ac.cn/handle/151853/75230
专题	昆明植物所硕博研究生毕业学位论文
推荐引用方式 GB/T 7714	马灿容. 转录因子MYC2 调控玉米抗虫响应的机制研究[D]. 中国科学院大学,2022.

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马灿容-马灿容博士毕业论文-最终版807（21412KB）	学位论文		限制开放	CC BY-NC-SA	请求全文