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| 芸香竹笋期快速生长的全基因组DNA甲基化研究 | |
| 牛亮仲 | |
| Thesis Advisor | 郭振华 |
| Keyword | 芸香竹，DNA甲基化，基因表达，节间伸长，木本竹类 Bonia amplexicaulis, DNA methylation, Gene expression, Internode elongation, Woody bamboos |
| Abstract | DNA甲基化与植物生长发育密切相关。与其他禾本科植物相比，木本竹类植物在茎秆发育早期（即笋期）具有快速生长的独特性状。然而，迄今还没有关于DNA甲基化在竹子笋期快速生长中的作用方面的研究。在本研究中，我们以热带木本竹类芸香竹（Bonia amplexicaulis (Chia et al.) N. H. Xia）为研究对象，首先通过绘制其笋期节间的生长曲线，结合石蜡切片结果，将笋期生长分为5个不同的发育阶段。通过对芸香竹笋期不同阶段的样本进行全基因组亚硫酸氢盐DNA甲基化测序（WGBS）以及与相应的转录组测序相结合的方法进行系统的研究，以期揭示芸香竹笋期快速生长的DNA甲基化调控机制，对深入解析木本竹类笋期快速生长之谜，以及对竹类资源合理开发利用具有重要的科学意义。主要结果如下： （1）笋期节间生长曲线及解剖学分析 本研究通过近两个月的野外观察，记录芸香竹盛笋期113株笋的株高生长及节间伸长数据；解剖了61株笋，得到了芸香竹竹笋的株高生长曲线和第5、6、7节节间生长曲线。节间伸长遵循“慢-快-慢”的规律（S曲线）。芸香竹茎秆株高的快速生长，是多个节间同时快速伸长的结果，从笋基部开始，向上逐节伸长。因此，本研究以节间的生长模式代替整个茎秆的生长模式。第5、6、7节节间生长模式相同，因此我们选取胸径所在的第6节节间做后续的研究。基于节间生长曲线，我们将芸香竹节间生长分为5个不同的生长发育阶段，即ST1-ST5。ST1是生长潜伏期（整个笋高15cm左右）；ST2-ST4分别是快速生长前期（第6个节间长度5cm左右）、快速生长中期（第6个节间长度20cm左右）、快速生长后期（第6个节间长度35cm左右）；ST5是生长平台期（第6个节间长度40cm左右）。在每个发育阶段，我们将胸径节所在处第6节间分为从基部到梢部等长的N1、N2、N3三部分，以N2作为试验材料。 根据石蜡切片结果可知，随着竹笋的生长发育，节间各细胞体积逐渐增大，长度逐渐增长，细胞核数量逐渐减少，并且木质部细胞细胞核逐渐消失，纤维细胞的木质化程度逐渐增加，且在发育后期可以看到一些薄壁细胞也出现明显的木质化。 （2）比较转录组分析 本研究对芸香竹笋期节间5个发育时期做了相应的转录组测序，进行了比较转录组分析。与ST1相比，ST2、ST3、ST4、ST5中各有上调的差异表达基因1,768、3,005、4,398、1,749个，下调的差异表达基因2,215、4,134、6,016、2,816个。通过KEGG和GO富集分析，这些差异表达基因主要参与植物激素信号转导、内质网中的蛋白质加工、蛋白质转运、核糖体、MAPK信号途径、光合作用等与植物生长密切相关的途径。通过WGCNA分析得到的4个与快速生长相关的模块中的基因也在上述途径中显著富集。 在笋期茎秆的不同发育阶段，ST1-ST3时期纤维素合成酶基因的大量表达，使得节间细胞快速伸长和分裂，而ST2时期之后木质素合成相关基因的大量表达使节间细胞壁之间沉积大量木质素，也提高了节间的机械支撑性。此外，我们发现在ST3阶段之后，由于节间的快速伸长突破了秆箨的包裹，裸露在外的茎秆开始光合作用，可能也对其快速生长起到比较重要的作用。 （3）全基因组DNA甲基化谱 通过WGBS测序及分析，我们发现芸香竹CG甲基化水平最高，其次是CHG，CHH最低，分别为~69% CG、~44% CHG和~3% CHH甲基化水平。从不同发育阶段来看，潜伏期ST1和平台期ST5的DNA甲基化水平显著高于快速生长期（ST2-ST4）。在快速生长的前中后时期，DNA甲基化水平呈缓慢上升趋势。CHH的甲基化水平在整个节间的发育过程中呈上升趋势。mCG、mCHG和mCHH分别占ST1中总mC的53%、37%和10%，从ST1到ST5，mCHH 的比例逐渐增加，而CG和CHG的比例逐渐下降。从全基因组水平来看，芸香竹基因组中TEs富集区域观察到高水平的CG和CHG甲基化。相反，TEs密度低的区域CG和CHG甲基化水平降低。基因的密度跟TE的密度正好相反。而CHH的甲基化水平跟CG与CHG相反，在基因密集区域表现出较高的CHH甲基化水平，在禾本科其他物种中也发现类似的规律。我们发现CG 和CHG甲基化在启动子区域与基因表达呈负相关，而CHH甲基化在启动子区域与基因表达呈正相关。通过对16种不同亚型的DNA甲基化motif类型分析，我们发现中间C的甲基化会影响第一个C的甲基化，但目前尚不清楚其机制。 （4）不同发育时期差异DNA甲基化分析 本研究发现潜伏期ST1和平台期ST5的CG和CHG甲基化水平显著高于快速生长期（ST2-ST4），这主要是因为去甲基化酶基因ROS1和DML3等基因在快速生长期高度表达。为了比较不同发育时期的DNA甲基化水平，我们以潜伏期ST1为对照，分别对ST2至ST5相对于ST1进行了差异性甲基化区域（DMRs）分析。与ST1相比，在ST2、ST3、ST4、ST5中分别鉴定出26,409、29,807、30,328、30,150个高甲基化DMRs和38,850、37,006、36,300、31,530个低甲基化DMRs。在这些DMRs中主要是CG和CHG，主要位于基因间区和外显子区。我们对上述各组鉴定到的DMRs进行了overlap分析。ST2-ST4共享了10,807个Hyper-DMRs和12,840个Hypo-DMRs，ST2-ST4中共有的这些Hypo-DMR在ST1表现出相对较高的DNA甲基化水平，但在茎秆的快速生长阶段（ST2-ST4）保持稳定的低DNA甲基化水平，并在ST5阶段出现DNA甲基化水平的再次增加。这些Hypo-DMRs相关联的基因主要参与植物激素信号转导、蛋白质合成等与植物生长密切相关的通路。在这些基因中，我们鉴定到一个负调控茉莉酸（JA）信号通路的JAZ基因（Bam0002289）、一个生长素信号转导途径的转录因子ARF（Bam0029485）、一个木质素合成途径的关键酶基因PAL（Bam0001978）和一个可能与细胞伸长有关bHLH转录因子（Bam0026640）。这些基因的表达量与启动子区DNA甲基化水平相符。总之，本研究表明DNA甲基化通过调控与快速生长相关的基因的表达来调控竹笋的快速生长过程。 此外，我们发现芸香竹CHH甲基化水平随着发育阶段逐渐升高，且这些变化主要发生在TEs区域，我们推测其可能与年龄/发育相关。为此，我们鉴定到大约100,000个随着发育时间CHH甲基化水平逐渐增加的TEs，这些TEs在基因组上并没有表现出类型偏好，除MITE类型的TEs之外，几乎所有类型的TE都有涉及。这些TEs可以为鉴定木本竹类的生物学年龄提供新的线索。 |
| Language | 中文 |
| 2022-08 | |
| Degree Grantor | 中国科学院大学 |
| Document Type | 学位论文 |
| Identifier | http://ir.kib.ac.cn/handle/151853/75219 |
| Collection | 昆明植物所硕博研究生毕业学位论文 |
| Recommended Citation GB/T 7714 | 牛亮仲. 芸香竹笋期快速生长的全基因组DNA甲基化研究[D]. 中国科学院大学,2022. |
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| 牛亮仲-博士学位论文-牛亮仲3a3265（12411KB） | 学位论文 | 限制开放 | CC BY-NC-SA | Application Full Text | ||
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