四株内生菌代谢产物及放线菌酮 酚 的生物合成研究

	四株内生菌代谢产物及放线菌酮酚的生物合成研究
	唐俊
导师	黄胜雄
关键词	内生菌，天然产物放线菌酮放线菌酚生物合成 E ndophyte s Natural products C ycloheximide Actiphenol B iosy n- thesis
摘要	微生物天然产物是药物发现的重要来源，由于其独特、新颖的化学结构和广泛的生物活性备受化学家和药物学家的青睐。本研究对四株植物内生菌的次级代谢产物进行分离与结构鉴定，并对其中一类化合物的生物合成途径进行了详细解析。本论文从Scopulariopsis candelabrum KIBint-20（来源于茶树），Aspergillus sp. KIB-HACM01（来源于苹果）, Trichoderma viride KIB11422（来源于酸角树）和Streptomyces sp. Zzx（来源于杜鹃）四株内生菌中共分离鉴定34个单体化合物，其中8个为新化合物。八个新化合物分别是6个单体/二聚-烯二酸类化合物，1个Preaustinoid类化合物和1个sorbicillinol类化合物。26个已知化合物包括5个单体/二聚-烯二酸类化合物，1个脂肽类化合物，4个杂萜类化合物，4个脂肪酸类化合物，1个PKS-NRPS类化合物，9个sorbicillinoid二聚类化合物和2个戊二酰亚胺类化合物。在抗真菌实验中发现烯二酸类化合物1（1233A）对Candida albicans（MIC = 20.0 μg/ml）和Exserohilum turcicum（IC50 = 21.2 μg/ml）有显著的抑制活性。从Streptomyces sp. Zzx分离得到的戊二酰亚胺类化合物放线菌酮是一种良好的真核生物蛋白质合成抑制剂，被广泛的用作抗真菌剂和应用于蛋白质组学研究中。但是其生物合成机制并未被完整解析，特别是放线菌酮和放线菌酚结构中六元碳环的环合机制及同一途径中怎样分别合成环己烷和苯环结构单元？故本论文对其生物合成途径展开研究，并聚焦于途径中的后修饰合成六元碳环的相关酶。首先构建了S. sp. Zzx的基因组文库，筛选到含有目的基因簇的柯斯质粒（cosmid）。接着通过PCR-targeting的手段分别敲除了chxJ、chxI 和chxG三个后修饰基因，发现突变菌株S. sp. Zzx-?chxI 和S. sp. Zzx-?chxJ不再产生放线菌酮和放线菌酚，但菌株S. sp. Zzx-?chxG依然产放线菌酮和放线菌酚。后经基因组分析发现在基因簇外存在一个chxG的同源基因，在功能上能起到互补的作用。由于关键基因的体内敲除实验未能获得关键的中间体，随后我们采取半合成的方式来制备可能的关键中间体。首先，我们获得了一株能生产放线菌酮类似物9-methylstreptimidone的菌株，以发酵后分离获取的该化合物为前体，通过双羟基化和氧化的半合成路线获得了ChxG酶催化的可能底物–醛中间体（4-3），之后再经pinnick氧化获得了ChxJ酶可能的底物-羧酸中间体（4-4）。获得以上中间体之后，我们构建了ChxG的蛋白表达质粒，转化到BL21(DE3)菌株，获得了可溶性蛋白。酶活实验发现ChxG可以将醛中间体的双键还原。随后，通过合成手性2-甲基苯丙醛和手性柱HPLC分析，确定了ChxG催化还原2-甲基肉桂醛的产物2-甲基苯丙醛的手性（α位甲基S构型）。同时，我们也构建了chxJ与sfp基因共表达的载体，获得的ChxJ蛋白可以将羧酸中间体还原为醛中间体。同时在体外实验中，我们发现用化学试剂DMP氧化醛中间体的羟基成羰基后，该分子能发生自发的分子内环化和脱水芳构化，生成放线菌酚。我们推测途径中的P450蛋白ChxI可能起相同的氧化羟基为羰基的功能，故我们将羧酸中间体投入到ChxJ和ChxI的双酶体系中，同样也可以产生放线菌酚，证明了P450酶ChxI的功能。根据上述实验结果，我们最终推测放线菌酮和放线菌酚的合成是一条平行的途径：羧酸中间体被ChxJ的A结构域腺苷酸活化后，连接到ACP结构域形成酶底物复合体（4-4-ChxJ complex），P450蛋白ChxI氧化酶底物复合体上的羟基形成酮基；接着被氧化的复合体（oxidated 4-4-ChxJ complex）的硫酯被ChxJ的R结构域还原成醛基而解离下来。随后，根据解离下来的中间体（4-18）是否被ChxG蛋白识别分流成两条途径：第一条途径，解离下来的中间体自发发生分子内的Aldol缩合反应，再自发脱水芳构化生成放线菌酚（34）；第二条途径是解离下来的中间体的双键被ChxG还原，再发生分子内Aldol反应，脱水生成二氢放线菌酚（4-6），二氢放线菌酚被NAD（P）H还原双键生成脱氢放线菌酮（4-5），脱氢放线菌酮被ChxH还原酮基为羟基生成放线菌酮（33）。综上所述，本研究从四株内生菌中共分离鉴定34个单体化合物，首次发现了8个新化合物，进一步丰富了天然产物的结构多样性。此外，通过体内和体外等实验，解析了放线菌酮和放线菌酚的生物合成途径，发现放线菌酮和放线菌酚的生物合成是两个平行的途径，并发现了由P450酶介导的六元碳环形成的新机制。放线菌酮生物合成途径的完整解析为其进一步的开发利用和组合生物合成研究奠定了坚实的基础。; Microbial-derived natural products are important sources of medicines。In this study, secondary metabolites from four plant-derived endophytes were isolated and identified.Among the isolates, the biosynthesis of cycloheximide and actiphenol were studied. Eight new compounds and 26 known compounds were isolated from the four endophytic strains Scopulariopsis candelabrum KIBint-20 (from Camellia sinensis (L.) O. Ktze.), Aspergillus sp. KIB-HACM01 (from Malus pumila Mill.), Trichoderma viride KIB11422 (from Tamarindus indica Linn.) and Streptomyces sp. Zzx (from Rhododendron simsii Planch.). The structure type of eight new compounds includes six mono-/bis- alkenoic acid derivatives, one preaustinoid, and one sorbicillinol. The 26 known compounds were composed of diverse structures including five mono-/bis- alkenoic acid derivatives, one lipopeptide, four heteroterpenoids, four fatty acids, one PKS-NRPS compound, nine sorbicillinoid dimerized compounds, and two glutarimide compounds. All the isolates were tested for antimicrobial activities, alkenoic acid derivative 1 (1233A) was found to have inhibitory activity against Candida albicans (MIC = 20.0 μg/ml,) and Exserohilum turcicum (IC50 = 21.2 μg/ml). The glutarimide compound cycloheximide isolated from Streptomyces sp. Zzx is a good eukaryotic protein synthesis inhibitor, and is widely used in antifungal and proteomics research. At the same time, its biosynthetic mechanism has not been fully resolved, especially the cyclization mechanism of the six-membered carbon ring in the structure of cycloheximide and actiphenol and how to synthesize cyclohexane and benzene ring respectively in the same pathway. Therefore, we investigate their biosynthetic pathway with a focus on post-modifying enzymes involving six-membered carbon ring formation. First, we constructed the cosmid library of S. sp. Zzx and screened the cosmids containing the target gene cluster. Then, the three post-modification genes chxJ, chxI and chxG were knocked out by PCR-targeting, and it was found that the mutant strains S. sp. Zzx-?chxI and S. sp. Zzx-?chxJ no longer produce cycloheximide and actiphenol, but the strain S. sp. Zzx-?chxG still produces cycloheximide and actiphenol. After genome analysis, it was found that there is a homologous gene of chxG outside the gene cluster, which plays a complementary role in function. The mutant strains obtained by in vivo knockout experiments failed to accumu-late the wanted key intermediates. We then switched to carrying out in vitro functional validation using the synthetic substrates. Fortunately, we ob?tained a high-yield producing strain of 9-methylstreptimidone. Using this compound as a precursor, it was subjected to double hydroxylation and oxidation to obtain the putative ChxG enzyme-catalyzed substrate aldehyde intermediate (4-3), and then by pinnick oxidation to obtain the putative substrate carboxylic acid intermediate（4-4）for ChxJ enzyme-catalyzed reaction. After obtaining the interm
语种	中文
	2022-05
学位授予单位	中国科学院大学
文献类型	学位论文
条目标识符	http://ir.kib.ac.cn/handle/151853/75206
专题	昆明植物所硕博研究生毕业学位论文
推荐引用方式 GB/T 7714	唐俊. 四株内生菌代谢产物及放线菌酮酚的生物合成研究[D]. 中国科学院大学,2022.

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唐俊-四株内生菌代谢产物及放线菌酮（酚）（13742KB）	学位论文		限制开放	CC BY-NC-SA	请求全文