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茵陈蒿和牛尾蒿的抗肝纤维化与抗肝癌活性成分研究
高振
Thesis Advisor陈纪军
Keyword茵陈蒿,牛尾蒿,茵陈香豆酸,倍半萜二聚体,倍半萜,抗肝纤维化活性,抗肝癌活性,细胞周期,凋亡 Artemisia capillaris, Artemisia dubia, Coumaric acids, Sesquiterpenoids, Sesquiterpenoid dimers, Antihepatic fibrosis effects, Antihepatoma activity, Cell cycle, Apoptosis
Abstract肝脏疾病种类繁多并严重影响患者的生活质量,目前肝纤维化和肝癌发病率急剧增高,在全球范围内,肝硬化每年导致约116万人死亡,死于肝癌的每年约有78.8万,约占世界死亡率的3.5%。对于肝纤维化的治疗临床上并未出现化学药物,一些候选药物也未达到预期的治疗效果。肝癌的药物治疗主要有酪氨酸激酶抑制剂 (索拉非尼、瑞格菲尼、乐伐替尼以及卡博替尼)、PD-1抑制剂 (纳武单抗和帕姆单抗) 和VEGFR-2抑制剂 (雷莫芦单抗),但因其耐药性和多种毒副作用,临床上需要研发化学结构类型不同,药理作用机制不同的抗肝癌药物。 天然小分子因其多样的化学结构和广泛的药理活性,是新药研发的重要源泉。因此,基于天然产物寻找结构新颖、具有不同作用机制的抗肝纤维化和抗肝癌先导分子意义重大。我们活性筛选表明茵陈蒿的乙醇提取物和牛尾蒿的乙醇提取物分别对肝星状细胞 (HSC-LX2) 和三株肝癌细胞 (HepG2、Huh7和SK-Hep-1) 具有明显抑制作用。为揭示茵陈蒿中抗肝纤维化和牛尾蒿中抗肝癌的活性成分,利用各种色谱分离方法 (硅胶、MCI gel CHP 20P、葡聚糖凝胶LH-20、Rp-C18、制备薄层色谱、制备型以及半制备型HPLC等) 和多种波谱鉴定技术 (HRESIMS、1D和2D NMR、IR、UV、ECD计算) 以及X-ray单晶衍射技术,系统研究了茵陈蒿和牛尾蒿两种蒿属植物的化学成分,分离鉴定了205个化合物,其中新化合物共89个,活性化合物68个。化合物结构类型主要涉及茵陈香豆酸 (含有异戊烯基取代的对羟基肉桂酸)、茵陈色原酮、倍半萜、倍半萜二聚体、单萜、酚酸类等。 抗肝纤维化活性筛选结果表明茵陈蒿中有3个化合物对HSC-LX2细胞具有显著的细胞毒活性,其IC50分别为85.0、46.1和24.5 μM,是阳性药物水飞蓟宾 (IC50为165.2 μM) 的2~7倍,有10个化合物具有与水飞蓟宾相当的活性。细胞外基质研究表明,活性最好的化合物1-34对I型胶原蛋白 (human collagen type Ⅰ, Col Ⅰ)、人类层粘连蛋白 (human laminin, HL) 和人类透明质酸 (human hyaluronic acid, HA) 的分泌具有显著的抑制作用,其IC50值分别为11.0、14.4和13.8 μM。 抗肝癌活性测试结果表明牛尾蒿中19个倍半萜二聚体,37个倍半萜以及2个木脂素类化合物对三株肝癌细胞 (HepG2、Huh7和SK-Hep-1) 具有较强的细胞毒活性,4个愈创木烷倍半萜二聚体 (2-2、2-4、2-13和2-18) 对三株肝癌细胞均具有较阳性索拉非尼 (IC50 13.1, 11.3, 20.5 μM) 更强的细胞毒活性,其IC50值分别为5.4, 5.7, 9.7, 12.7 μM (HepG2); 8.2, 4.3, 12.2, 8.9 μM (Huh7); 13.4, 8.4, 12.9, 5.9 μM (SK-Hep-1)。进一步探讨了倍半萜二聚体化合物2-4在HepG2细胞上的细胞毒作用机制,结果表明化合物2-4能使细胞阻滞在G1/M期,同时能诱导细胞凋亡,作用机制新颖。 本论文深入研究了茵陈蒿和牛尾蒿的化学成分,初步揭示了茵陈香豆酸类成分可能为茵陈蒿中抗肝纤维化活性的物质基础;牛尾蒿中的倍半萜二聚体和倍半萜类成分对三株肝癌细胞具有细胞毒活性,为茵陈蒿和牛尾蒿的应用以及寻找新颖结构的对肝病有治疗作用的活性分子提供了重要的化学和药理学依据。 本论文还对茵陈蒿的化学成分和药理作用研究进行了综述。 第1章 茵陈蒿抗肝纤维化活性成分研究 茵陈蒿 (Artemisia capillaris) 系菊科蒿属植物 (Artemisia),是中药茵陈的两种基源植物之一。据文献报道,茵陈蒿的水提物可以减轻四氯化碳诱导引起的大鼠肝脏纤维化状态。然而,对于茵陈蒿中的具体抗肝纤维化活性成分尚不明确。我们研究发现茵陈蒿的乙醇提取物对HSC-LX2细胞具有抑制作用,在浓度为400 μg/mL时其抑制率达68.7 %。为探究茵陈蒿中抗肝纤维化活性成分,以HSC-LX2细胞毒活性为导向,利用硅胶、葡聚糖凝胶LH-20、MCI gel CHP 20P、半制备HPLC等柱层析分离手段,以及各种波谱方法 (UV、IR、HRESIMS、NMR、ECD计算和X-ray单晶衍射),从乙酸乙酯部分离鉴定了60个化合物,其中包括29个新化合物,分别为27个新的茵陈香豆酸类和2个新的茵陈色原酮类化合物。对分离得到的化合物进行了HSC-LX2细胞毒活性测试,结果表明3个化合物 (1-14、1-27和1-34) 对HSC-LX2细胞具有显著的细胞毒活性,是阳性药物水飞蓟宾 (IC50为165.2 μM) 的2~7倍,有10个化合物 (1-2、1-3、1-6、1-9、1-13、1-19、1-35、1-38和1-47~1-46) 具有与水飞蓟宾相当的活性。细胞外基质研究表明,活性最好的化合物1-34对I型胶原蛋白 (human collagen type Ⅰ, Col Ⅰ)、人类层粘连蛋白 (human laminin, HL)和人类透明质酸 (human hyaluronic acid, HA) 的分泌具有明显的抑制作用,IC50值分别为11.0、14.4和13.8 μM。 第2章 牛尾蒿抗肝癌活性成分研究 牛尾蒿 (Artemisia. dubia) 为菊科蒿属多年生草本植物,为中国特有种,分布于内蒙古、甘肃、四川、云南、西藏等地。我们发现牛尾蒿乙醇提取物和各流分在200.0 μg/mL时,对三株肝癌细胞 (HepG2, Huh7, SK-Hep-1) 具有抑制作用,抑制率分别为79.3%,73.1%,61.9%。为了揭示牛尾蒿中抑制肝癌细胞的活性成分,利用各种色谱分离方法,(如硅胶柱色谱、凝胶柱色谱、MCI gel CHP 20P 柱色谱和半制备型 HPLC等),对活性较好的流分 Fr. AD-3、Fr. AD-4和Fr. AD-5进行分离纯化,采用多种波谱学分析手段 (HRMS, IR, 1D 和 2D NMR, ECD) 和X-ray单晶衍射技术对其进行结构鉴定,共分离鉴定145个化合物,包括新化合物65个。新化合物结构类型有倍半萜二聚体类化合物20个 (2-1~2-17和2-19~2-21),涉及4种不同的缩合方式;倍半萜类新化合物涉及一种新颖骨架倍半萜2个 (2-109~2-110),33个愈创木烷型 (2-25, 2-42~2-62, 2-64~2-71, 2-25和2-78~2-79),1个桉烷型 (2-95),1个金合欢烷 (2-104) 和2个长叶蒎烷型 (2-99~2-100);其他类新化合物包括,2个单萜 (2-112和2-120),2个木脂素 (2-121~2-122) 和2个酚类化合物 (2-127~2-128)。 活性筛选表明19个倍半萜二聚体,37个倍半萜以及2个木脂素类化合物对三株肝癌细胞 (HepG2、Huh7和SK-Hep-1) 具有较强的细胞毒活性。尤其是4个愈创木烷倍半萜二聚体 (2-2、2-4、2-13和2-18) 对三株肝癌细胞均具有较阳性索拉非尼 (; Liver diseases are diverse and have a serious effect on the life quality of patients, and the incidence of liver fibrosis and liver cancer currently increases dramatically. Globally, liver cirrhosis kills approximately 1.16 million people each year and liver cancer kills around 788,000, accounting for approximately 3.5% of the world’s mortality. There are no clinically available drugs for the treatment of liver fibrosis, and some drug candidates have not achieved the desired therapeutic effect. The main drug treatments for hepatocellular carcinoma involve in tyrosine kinase inhibitors (sorafenib, regrafinib, levatinib and cabozantinib), PD-1 inhibitors (navutumumab and palmimab) and VEGFR-2 inhibitor (ramucirumab), but they are prone to resistance and various side-effects. Natural small molecules are important sources of new drug discovery due to their diverse chemical features and wide range of pharmacological activities. Therefore, it is of great significance to search for lead molecules with novel structures and different mechanisms against liver fibrosis and liver cancer derived from natural products. The results of the preliminary activity screening showed that EtOH extracts of A. capillaris and A. dubia inhibited liver fibrosis cell HSC-LX2 and three hepatocellular carcinoma cells (HepG2, Huh7 and SK-Hep-1), respectively. In order to reveal the antiliver fibrosis and antihepatoma carcinoma constituents of A. capillaris and A. dubia, various chromatographic methods (silica gel, MCI gel CHP 20P, sephadex LH-20, Rp-C18, preparative TLC, preparative and semi-preparative HPLC, etc.), spectral identification techniques (HRESIMS, 1D and 2D NMR, IR, UV, ECD calculations) and X-ray diffraction analysis were used. A total of 205 compounds were isolated and identified, of them 89 new compounds were elucidated, which involved coumaric acid analogues, 2-phenoxychromones, sesquiterpenoids, sesquiterpenoid dimers, monoterpenes and phenolic acids. The results of the antiliver fibrosis assay showed that three compounds from A. capillaris showed significant cytotoxic activity against HSC-LX2 cells, which was 2~7 times higher than the positive drug silybin (IC50: 165.2 μM), and 10 compounds exhibited activity comparable to that of silybin. Extracellular matrix studies revealed that the most active compound 1-34 showed significant inhibition on the secretion of human collagen type I (Col Ⅰ), human laminin (HL) and human hyaluronic acid (HA). The isolated compounds from A. dubia were evaluated for their hepatomatic cytotoxicity against HepG2, Huh7, and SK-Hep-1 cell lines to demonstrate that 19 sesquiterpenoid dimers, 37 sesquiterpenoids and two lignans display strong cytotoxic activity against three tested hepatoma cell lines, and four guaianne-type sesquiterpenoid dimers (2-2, 2-4, 2-13 and 2-18) show stronger cytotoxic activity than the positive sorafenib (13.1, 11.3, 20.5 μM) with IC50 values of 5.4, 5.7, 9.7, 12.7 μM (HepG2); 8.2, 4.3, 12.2, 8.9 μM (Huh7);
Language中文
2022-05
Degree Grantor中国科学院大学
Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.kib.ac.cn/handle/151853/75196
Collection昆明植物所硕博研究生毕业学位论文
Recommended Citation
GB/T 7714
高振. 茵陈蒿和牛尾蒿的抗肝纤维化与抗肝癌活性成分研究[D]. 中国科学院大学,2022.
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