小立碗藓HDS基因功能的挖掘及在耐高温改良中的潜在应用

	小立碗藓HDS基因功能的挖掘及在耐高温改良中的潜在应用; The functional analysis of HDS genes in Physcomitrella patens and its potential application in improving tolerance to high temperature
	刘丽娜
导师	刘莉
学位专业	生物工程
关键词	耐高温性 HDS 逆行信号分子 MEcPP 小立碗藓
摘要	高温是威胁植物生存最严重的环境胁迫之一，它严重危害着世界范围作物的生产。如何增强作物的耐高温性是我国农业作物生产中待解决的重要问题之一。因此，解析植物耐高温的分子机理对作物的分子育种和产量提高具有重要的理论指导意义和潜在的经济价值。MEcPP是近年来新发现的一种逆行信号分子，它也参与了植物对高温的响应，但其具体的分子机制研究还处于空白状态。本研究通过对小立碗藓（Physcomitrella patens）中控制MEcPP含量的HDS基因的功能进行了研究，初步探究小立碗藓中逆行信号分子MEcPP响应高温的分子机理, 从而为其应用于改良植物的耐高温性方面提供了科学依据。本研究得到的主要结果总结如下：1. 小立碗藓中存在3个与拟南芥HDS高度同源的基因：分别命名为HDS19, HDS21和HDS22。它们的氨基酸序列在酶的结合结构域和催化结构域上都高度保守。2. 小立碗藓的3个HDS基因在各个生长发育阶段几乎都有表达，其中HDS19基因的表达量最高，HDS21次之， HDS21的表达量最低。3个HDS基因具有完全不同的表达模式：HDS19的表达在假根中最高；HDS21在孢子囊中的表达最高；HDS22在绿丝体阶段表达量最高，在轴丝体阶段表达较低。3. 小立碗藓3个HDS基因编码的蛋白均定位于叶绿体，其N端的55-69个氨基酸是叶绿体定位的信号肽。4. 生长3周的野生型小立碗藓经45℃ 高温处理60 min，90 min后，MEcPP的含量显著降低。高温处理恢复1 d和8 d后，MEcPP的含量进一步显著降低。另外，野生型小立碗藓经高温处理后3个HDS基因的表达会受到抑制，而在高温恢复1 d 后3个HDS基因的表达显著上调，从而导致高温恢复后MEcPP的含量显著降低。所以高温对MEcPP含量的影响是部分通过影响HDS基因的表达来实现的。5. 通过CRISPR-Cas基因编辑技术，我们分别对小立碗藓的3个HDS基因进行了敲除。在获得的HDS基因编辑植物中，HDS21和HDS22基因上均发生碱基缺失和插入，并造成了移码突变，导致HDS21和HDS22基因功能的缺失。而HDS19基因编辑植物中，不论是编辑启动子区还是编码区均只有碱基缺失，且缺失的碱基数均是3的倍数，并不会导致移码突变。因此，我们推测HDS19基因功能的完全丧失可能是致死的。6. 在正常生长条件下，生长6周的hds21功能缺失突变体中生长素含量显著增加，使小立碗藓的茎长变长。但是，由于HDS21突变引起了HDS19和HDS22基因的补偿表达，hds21突变体中MEcPP含量仅比野生型略微增加，使得hds21突变体没有表现出更强的高温耐受性。7. 在正常生长条件下，生长6周的hds22功能缺失突变体与野生型在发育上虽然没有明显的表型差异，但hds22突变体中显著积累MEcPP从而引起小立碗藓中胁迫响应相关的内质网解折叠蛋白响应（unfolded protein response, UPR）途径和水杨酸（salylic acid, SA）途径的基因表达显著上调,并且水杨酸的含量也显著增加。此外，在经高温处理后和高温处理后恢复8天，hds22突变体中MEcPP的含量总是显著高于野生型，这与hds22突变体更抗高温的表型一致。综上所述，我们推测小立碗藓HDS22基因突变引起MEcPP含量的显著积累进而触发UPR和SA途径基因上调表达，从而增加的植物的耐高温性。8. 正常生长条件下，hds21 hds22 双突相比野生型能更快地从原丝体阶段向配子体阶段转型，并且表现出更强的高温耐受性。虽然hds21 hds22 双突由于HDS19显著上调并没有积累MEcPP，但是当高温处理后抑制了HDS19的表达后，hds21 hds22 双突中MEcPP的含量显著增加，从而表现出更强的高温耐受性。9. 在正常条件下，小立碗藓hsfa1 hsfb4双突和 hsfa1 hsfa2 hsfb4三突中3个HDS基因表达明显上调，高温恢复后HDS19和HDS22基因的上调表达在这些突变体中被消除了，表明HDS19和HDS22基因的表达依赖于热激转录因子HSFA1、HSFA2和HSFB4。综上所述，我们的结果表明：在小立碗藓中，高温会影响HDS基因的表达进而影响MEcPP的积累。MEcPP的显著积累又会引起内质网解折叠响应（UPR）途径关键基因表达的上调，最终使植物更耐高温胁迫。这些结果表明MEcPP介导的逆行信号途径是一种进化上保守的、植物响应胁迫（例如高温）的重要机制。重要的是，本研究发现热激转录因子HSFs是一个新的MEcPP介导的逆行信号途径的关键调控因子。HDS基因的表达和MEcPP的积累部分依赖于热激转录因子HSFs。由于MEcPP积累不仅能够使小立碗藓茎长变长，而且可以提高其耐高温性，因此，我们推测HSFs可以作为一个分子开关，它能够通过调控HDS的表达进而调控MEcPP的含量从而调控植物的生长和耐高温胁迫之间的平衡。
	2019-06
学位授予单位	中国科学院昆明植物研究所
学位名称	硕士
文献类型	学位论文
条目标识符	http://ir.kib.ac.cn/handle/151853/74049
专题	昆明植物所硕博研究生毕业学位论文
推荐引用方式 GB/T 7714	刘丽娜. 小立碗藓HDS基因功能的挖掘及在耐高温改良中的潜在应用, The functional analysis of HDS genes in Physcomitrella patens and its potential application in improving tolerance to high temperature[D]. 中国科学院昆明植物研究所,2019.

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2016E8010661050+刘丽娜.（19043KB）	学位论文		限制开放	CC BY-NC-ND	请求全文