重组多酚氧化酶生成茶黄素的研究

	重组多酚氧化酶生成茶黄素的研究; Research on Recombinant Polyphenol Oxidases for Production of Theaflavins
	曾俊
导师	曾英
学位专业	生物化学与分子生物学
关键词	茶黄素重组多酚氧化酶酶固定酶促合成
摘要	茶黄素（Theaflavins，简称TFs）是一类含有卓酚酮结构的化合物，其是通过氧化一个含有二羟基的B环和另一个含有三羟基的B环的儿茶素形成。TFs除了对红茶的颜色和滋味有重要作用外，还拥有许多生物活性，其最早是在红茶中分离发现的，但在红茶中的含量较低，直接从红茶中分离提取TFs是不经济的，因此采用儿茶素模拟氧化制备TFs被视为行之有效的方法。模拟氧化按催化剂的不同分为化学氧化和酶促氧化。化学氧化因其不符合生态保护的要求且存在底物专一性差，副产物复杂，产品纯度低等问题而限制了其应用。酶促氧化主要是利用多酚氧化酶（PPO）和过氧化物酶（POD）的氧化特性来有目的地生成TFs。在反应过程中，PPO主要生成TFs和相对简单的二聚体，而POD不仅能生成TFs，还能将TFs进一步氧化为结构更为复杂的多聚体茶红素。因此，本论文主要采用PPO酶促氧化制备TFs。目前，PPO主要是利用现代分离纯化技术直接从植物或真菌中分离纯化得到，且大部分PPO都停留在酶学特性的研究上，限制其应用的原因可能是分离纯化的过程比较繁复。因此，如何获得大量且有活性的PPO成为TFs研究和应用的关键，通过基因工程手段在体外表达PPO对于制备TFs有重要的理论和实际意义。目前大约有50种植物和10种真菌的PPO基因被克隆，基因序列近百条。本论文从中筛选出部分PPO基因来进行异源表达并用于TFs的合成。首选已经进行过异源表达的PPO基因，其次为近年来研究比较热门的PPO基因。此外，由于游离酶不能重复使用且在极端pH、高温和储藏条件下易于失去活性，阻碍了其在工业中的应用。利用酶固定技术能有效的克服游离酶的这些缺陷，为扩大规模和商业化生产TFs提供一定的理论基础。纳米材料由于拥有较大比表面积和良好的生物相容性而在酶固定领域吸引了较多关注，交联酶聚集体（CLEAs）技术也是近年来发展起来的一种新型的无载体酶固定技术。本论文将异源表达成功且活性较好的PPO固定到纳米载体上或者利用CLEAs技术进行酶固定以获取活性高、稳定性好的固定酶。主要结果如下：（1）根据文献报道，对10个物种中的17条PPO基因进行克隆，然后将测序正确的基因构建到表达载体pET32a(+)上并转入BL21(DE3)中进行异源表达，其表达的蛋白分子量符合预期大小且大部分PPO的表达量高、可溶性好。（2）重组的PPO粗酶活性鉴定结果表明8个PPO有催化合成TFs的活性，这是首次利用PPO重组酶催化合成TFs，通过分析LC-MC检测结果可知其合成TFs活性大小为：Pp4（梨）>Md2（苹果）>Ej2（枇杷）>Jr2（核桃）>Jr1>Vv-1（葡萄）>Cg1（金鸡菊）>Vv-5。（3）将重组的PPO粗酶进行酶固定，结果显示以介孔二氧化硅为载体的固定酶活性最高。将粗酶活性较高的Ej2、Md2和Pp4分别固定到介孔二氧化硅上，结果表明固定后的Md2活性最高。遂将Md2纯化后再进行固定，发现纯酶固定后的活性明显提高，几乎是游离酶的两倍。此外，游离酶在pH 5和10–30℃条件下有最大活性，而固定酶则显示出更宽的最大活性范围（pH 4–6和10–40℃）。在pH稳定性和热稳定性方面，固定酶的活性基本保持不变，而游离酶的活性有升高，但仍低于固定酶的活性。固定酶经过8次重复使用和4℃储藏25 d后分别有近40%和70%的初始酶活性得以保留。论文第一章主要介绍了选题背景及意义、本论文提出及拟解决的关键问题。论文第二章主要阐述了植物与真菌PPO基因的异源表达及其合成TFs的功能鉴定。首先，利用植物组织PPO粗酶合成TFs，通过该实验初步确认了合成TFs的条件以及不同物种合成TFs的活性大小。其次，根据文献报道以及实验指导对10个物种的17条PPO基因进行克隆，分别是：Ab3（Agaricus bisporus）、Ab4、Bv1（Boreostereum vibrans）、Bv2、Cs（Camellia sinensis）、Cg1（Coreopsis grandiflora）、Ej2（Eriobotrya japonica）、Ej3、Ib（Ipomoea batatas）、Jr1-m（Juglans regia）、Jr1、Jr2、Md2（Malus domestica）、Md3、Pp1（Pyrus pashia）、Pp4、Vv（Vitis vinifera），对克隆得到的基因进行测序并将测序正确的基因Ab3、Ab4、Cs、Cg1、Ej2、Ib、Jr1-m、Jr1、Jr2、Md2、Md3（1号和6号）、Pp1、Pp4、Vv（1号和5号）构建到表达载体pET32a(+)上并转入BL21(DE3)中进行异源表达。由于植物PPO基因普遍含有信号肽，所以在构建表达载体时需去掉信号肽。通过改变诱导温度、IPTG浓度等条件，实现了重组酶的可溶表达。以茶多酚为底物的活性鉴定结果表明8个重组PPO有催化合成TFs的活性且活性大小为：Pp4>Md2>Ej2>Jr2>Jr1>Vv-1>Cg1>Vv-5。论文第三章主要讲述了PPO重组酶生物转化制备TFs的研究。首先，比较了提取酶在游离和固定状态下合成TFs的活性情况。在酶固定实验中，既采用了有载体的固定（介孔二氧化硅和碳纳米管），同时也采用了无载体的CLEAs技术；在固定方法上也优选了几种当前可行性较高的方法进行固定。固定后的酶活性显示以介孔二氧化硅为载体的固定酶活性最高，依次为碳纳米管、CLEAs技术。其次，还考察了全细胞催化合成TFs的活性情况。运用底物饲喂、静息方法对PPO全细胞的活性进行了鉴定，结果表明无TFs生成。论文第四章主要对植物与真菌PPO的研究进行了综述。首先，介绍了PPO的种类和当前最新的催化机理。其次，对植物和真菌天然PPO的研究进行了归纳和总结，包括分离纯化新物种PPO、底物特异性和抑制剂的探究等。同样，对植物和真菌PPO酶基因的研究也进行了概括和汇总，包括基因克隆以及异源表达等。最后，介绍了PPO生物转化在各个领域中的应用。
	2019-06
学位授予单位	中国科学院昆明植物研究所
学位名称	博士
文献类型	学位论文
条目标识符	http://ir.kib.ac.cn/handle/151853/74032
专题	昆明植物所硕博研究生毕业学位论文
推荐引用方式 GB/T 7714	曾俊. 重组多酚氧化酶生成茶黄素的研究, Research on Recombinant Polyphenol Oxidases for Production of Theaflavins[D]. 中国科学院昆明植物研究所,2019.

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曾俊+重组多酚氧.pdf（14254KB）	学位论文		限制开放	CC BY-NC-ND	请求全文