抗肿瘤剂链黑菌素合成酶StnK3基于同源蛋白MarH的序列优化与表达纯化

	抗肿瘤剂链黑菌素合成酶StnK3基于同源蛋白MarH的序列优化与表达纯化; Expression and Purification of Anti-tumor Agent Synthetase StnK3 Based on it’s Homologous Protein MarH
	方诗琪
导师	胡凯锋
学位专业	药理学
关键词	链黑菌素 StnK3 MarH 蛋白纯化液态核磁共振
摘要	链黑菌素(Streptonigrin, STN)是由链霉菌(Streptomyces flocculus)产生的一种氨基苯醌类生物碱，具有广谱的抗肿瘤活性。StnK3是STN合成过程中至关重要的酶，当且仅当StnK3催化(3R)-b-甲基吲哚丙酮酸立体结构翻转形成(3S)-b-甲基吲哚丙酮酸，再经过后续步骤才能生成链黑菌素。MarH是Maremycins合成过程中重要的立体异构酶，其参与反应与StnK3一致，也是催化(3R)-b-甲基吲哚丙酮酸立体结构翻转形成(3S)-b-甲基吲哚丙酮酸。MarH是StnK3的同源蛋白，已基于NMR图谱完成了主侧链归属，且解析了其晶体结构。基于我们对MarH的研究基础，通过序列对比优化StnK3是一种科学可行的方法。本文主要在MarH的研究指导下研究StnK3蛋白的核磁蛋白样品制备，通过对已经完成MarH的主链和侧链核磁共振化学位移归属及三维结构解析的基础上分析，优化StnK3蛋白的溶解度，聚合状态以及稳定性等，使得蛋白样品达到利用核磁共振技术或晶体衍射技术进行三维结构和催化机制研究的要求。首先，本研究对野生型StnK3的表达和纯化进行了探索，发现StnK3野生型作为核磁解析结构的样品明显存在溶解性差和聚合状态不均一的问题。本研究也摸索和进行了MarH的表达纯化，其表达纯化得到的样品在凝胶层析纯化过程中呈现均一的二聚状态。由于两者高度同源，可能两者某一个或者几个不同的氨基酸导致了它们聚合状态不同。从StnK3和MarH的序列对比以及MarH的结构上看：StnK3和MarH两者不同的氨基酸主要集中在N端前12位氨基酸。从MarH的二聚体结构看来，N端的氨基酸外摆，两者的N端氨基酸不同可能介导不同的聚合。基于序列分析，对前12位氨基酸进行了突变或者截短等优化并构建相应的质粒，结果显示聚合状态没有改善。本研究通过一些列组合实验确定使得StnK3聚合状态不均一的氨基酸是处于N端前12位氨基酸还是除N端前12位氨基酸以外的氨基酸。通过将MarH的前10位氨基酸替换成StnK3的前12位氨基酸，以及StnK3的前12位氨基酸换成MarH的前10位氨基酸，两种实验相互验证了使得StnK3聚合状态不均一的氨基酸是位于StnK3的N端前12位氨基酸以外的氨基酸。我们进而对N端外的氨基酸进行突变优化，确定了V89R突变体可以明显提高StnK3溶解度，V65T突变体则可以明显提高不均一聚合物中二聚体所占比例。将两个突变综合在一起，发现双突变同时具有这两个突变的优点。进一步的实验证明了StnK3-V89R-V65T的二聚部分不会转化为四聚状态。利用核磁共振波谱仪对StnK3-V89R-V65T纯化后的二聚蛋白采集1H NMR图谱，谱峰分散显示蛋白具有良好的二级结构。但SDS-PAGE电泳发现StnK3-V89R-V65T构建的稳定性有待提高。为了进一步提高StnK3蛋白的稳定性，以达到蛋白核磁样品的稳定性要求，我们在双突变的基础上截短了N端的两个氨基酸。StnK3-V3-V65T-V89R构建聚合状态和溶解度都与StnK3-V65T-V89R基本相同，LC-MS确证了该蛋白的分子量符合理论值。核磁图谱显示该构建能保持1H-15N HSQC图谱一致性一周。本论文为利用液态核磁共振技术研究该蛋白的结构和催化机制奠定基础。
	2019-06
学位授予单位	中国科学院昆明植物研究所
学位名称	硕士
文献类型	学位论文
条目标识符	http://ir.kib.ac.cn/handle/151853/74021
专题	昆明植物所硕博研究生毕业学位论文
推荐引用方式 GB/T 7714	方诗琪. 抗肿瘤剂链黑菌素合成酶StnK3基于同源蛋白MarH的序列优化与表达纯化, Expression and Purification of Anti-tumor Agent Synthetase StnK3 Based on it’s Homologous Protein MarH[D]. 中国科学院昆明植物研究所,2019.

条目包含的文件
文件名称/大小	文献类型	版本类型	开放类型	使用许可
基于同源蛋白MarH的抗肿瘤剂链黑菌.p（2262KB）	学位论文		限制开放	CC BY-NC-ND	请求全文