鞘氨醇单胞菌Sphingobium sp. KIB类胡萝卜素合成研究

	鞘氨醇单胞菌Sphingobium sp. KIB类胡萝卜素合成研究; Study on the biosynthesis of carotenoids in Sphingobium sp. KIB
	刘萌萌
导师	黄俊潮
学位专业	生物化学与分子生物学
关键词	Sphingobiumsp.KIB 类胡萝卜素诱变基因工程发酵
摘要	类胡萝卜素是广泛存在于生物体中的萜类化合物，具有多种生物学功能。迄今天然类胡萝卜素难以满足日益增长的市场需求。寻找新的类胡萝卜素生物资源，有着深远的经济和社会意义。本实验室在前期工作中筛选到了一株高产类胡萝卜素的鞘氨醇单胞菌。目前国内外对该属物种的研究主要集中在降解环境污染物和生产胞外多糖，而本研究聚焦于其合成类胡萝卜素的研究。本论文就鞘氨醇单胞菌类胡萝卜素合成做了较为深入的探索，获得如下结果：1、根据表型和系统进化分析，确定所分离到的菌与鞘氨醇单胞菌菌株近缘，由于该菌与Sphingobium sp. SA2的16S rRNA基因的具有较高的同源性（97%），推测该菌株属于鞘氨醇单胞菌属，并命名为Sphingobium sp. KIB。UPLC分析发现Sphingobium sp. KIB主要积累念珠藻黄素，占总类胡萝卜素的比例高达93%，且每克干细胞含有2.42毫克念珠藻黄素。2、通过Illumina Hiseq2000测序平台，获得了Sphingobium sp. KIB的基因组信息，识别了和念珠藻黄素合成相关的所有基因。Sphingobium sp. KIB中类胡萝卜素合成前体物质异戊二烯焦磷酸（IPP）是通过甲基赤藓糖醇（MEP）途径合成，途径中缺失IPP异构酶基因idi。经基因功能互补实验验证了该菌参与念珠藻黄素合成的六个基因（crtE, crtB, crtI, crtY, crtZ和crtG）的功能，它们分别编码GGPP合成酶，八氢番茄红素合成酶，八氢番茄红素脱氢酶，番茄红素环化酶，β-胡萝卜素3’ 羟化酶，β-胡萝卜素2’ 羟化酶。其中CrtZ可能为类胡萝卜素合成限速酶，CrtG具有较强的底物特异性。3、经化学诱变剂甲基硝基亚硝基胍（MNNG）处理Sphingobium sp. KIB，共筛选到了4株遗传稳定的突变体：分别是不积累类胡萝卜素的Sphingobium sp. KIB-noc；积累八氢番茄红素的Sphingobium sp. KIB-phy；积累番茄红素的Sphingobium sp. KIB-lyc；积累玉米黄素的Sphingobium sp. KIB-zea。这4株突变体的生长均略低于野生型，但类胡萝卜素积累稳定，达到2.4 mg/g干重。4、以积累不同类胡萝卜素的Sphingobium sp. KIB菌株喂养线虫，发现类胡萝卜素对线虫寿命具有明显延长作用。与喂食大肠杆菌OP50相比，喂食产玉米黄素的鞘氨醇单胞菌可使线虫寿命延长41.84%，喂食番茄红素菌株寿命延长39.3%，喂食念珠藻黄素菌株寿命延长33.7%。惊喜的是，不产类胡萝卜素的鞘氨醇单胞菌也可延长线虫寿命18.8%。5、提取了Sphingobium sp. KIB中内源质粒，测序和确定了与质粒复制相关的最短基因片段。成功构建了大肠杆菌与Sphingobium sp. KIB间的穿梭质粒。为利用代谢工程改造鞘氨醇单胞菌提供基础条件。6、通过基因组学分析，选取9个有明显-35和-10区的内源启动子序列并克隆到莱茵衣藻β-胡萝卜素酮化酶基因（BKT）的上游，在产玉米黄素的突变体Sphingobium sp. KIB-zea中进行功能验证。通过比较转化子中虾青素的含量和BKT基因的表达量，发现启动子PGELB最利于类胡萝卜素的积累，而启动子PREL17驱动下的BKT转录水平最高。7、比较分析了10个可能影响Sphingobium sp. KIB-zea中玉米黄素合成的限速酶。异源表达大肠杆菌的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶基因（dxs）或IPP异构酶基因（idi）可显著提高菌体玉米黄素和总体类胡萝卜素的含量。然而共表达这两个酶却引发β-胡萝卜素的积累而较少的促进玉米黄素的合成。推测催化β-胡萝卜素成玉米黄素的反应为限速步骤。同时过表达dxs，idi和Brevundimnas sp. SD212的羟化酶基因crtZ使转化子（DIZ）的玉米黄素含量大幅度提高，可达21.26mg/g DCW，且玉米黄素所占比例高达90%。8、通过单因素实验方法，确定了生产玉米黄素的最佳PH，碳源，氮源，碳氮比和无机盐离子。综合上述实验结果，将工程菌DIZ在5升发酵罐培养。96小时时，玉米黄素产量可达479.5 mg/L，细胞干重为39.5 g/L。同时，培养上清液中含有21.9 g/L的胞外多糖。
	2019-06
学位授予单位	中国科学院昆明植物研究所
学位名称	博士
文献类型	学位论文
条目标识符	http://ir.kib.ac.cn/handle/151853/74016
专题	昆明植物所硕博研究生毕业学位论文
推荐引用方式 GB/T 7714	刘萌萌. 鞘氨醇单胞菌Sphingobium sp. KIB类胡萝卜素合成研究, Study on the biosynthesis of carotenoids in Sphingobium sp. KIB[D]. 中国科学院昆明植物研究所,2019.

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