AS160保护胰岛的功能研究及葡萄糖转运体筛选模型的建立

	AS160保护胰岛的功能研究及葡萄糖转运体筛选模型的建立
	逯艳婷
导师	熊文勇
学位专业	药理学
关键词	糖尿病 AS160 胰岛β细胞葡萄糖转运体药物筛选
摘要	糖尿病作为常见的内分泌代谢疾病，是由遗传因素和环境因素相互作用导致机体胰岛素分泌不足或胰岛素敏感性降低而引起的以高血糖为主要特征的代谢综合症。目前与糖尿病药物研发有关的研究主要集中在两个方面：新型糖尿病治疗靶点的发现和针对已知靶点的药物开发。本论文针对这两方面，探究160 kD的AKT底物(Akt substrate of 160 kDa, AS160)在胰岛β细胞中的作用及其机制，评价其作为糖尿病治疗靶点的潜力；建立并优化以葡萄糖转运体4 (Glucose transporters 4, GLUTs)和Na+依赖型葡萄糖转运蛋白2 (Sodium dependent glucose transporters 2, SGLT2)这两种葡萄糖转运蛋白为靶点的简便高效的高通量药物筛选模型。主要分为两个部分论述：AS160对胰岛的保护作用和机制研究（第一部分）和新型靶向葡萄糖转运体高通量药物筛选模型的建立与应用（第二部分）。第一部分 AS160对胰岛的保护作用和机制研究AS160作为一种GTPase激活蛋白，通过抑制Rab家族蛋白活性调节细胞内囊泡的运输。AS160参与胰岛素信号调控的GLUT4膜转运，进而调节肌肉和脂肪组织的葡萄糖摄取。AS160还调控水通道蛋白、钠钾ATP酶、钠离子通道蛋白和脂肪酸转位酶(Cluster of differentiation 36, CD36)等蛋白的跨膜运输等。有文献报道AS160参与调控胰岛β细胞增殖和胰岛素分泌，然而AS160在此过程中的具体作用机制并不清楚。本研究阐明了AS160正向调控胰岛β细胞增殖的作用及机制，并在体内评价了AS160在胰岛β细胞功能维持中发挥的作用。我们的结果表明AS160在小鼠胰腺组织中高表达，高浓度葡萄糖刺激后AS160磷酸化水平增加。小鼠胰腺组织免疫荧光结果发现，相较于正常小鼠，1型、db/db和2型糖尿病晚期的小鼠胰岛β细胞AS160表达水平下降，并且AS160与胰岛素共定位，提示胰岛β细胞中的AS160在糖尿病发生发展中具有重要作用。我们首次在体内探讨了AS160对胰岛β细胞功能的影响，结果显示过表达AS160可以降低小鼠血糖，促进胰岛素的合成和分泌，因此AS160过表达对于链脲佐菌素 (Streptozotocin,STZ)造成的胰岛β细胞损伤具有保护作用。进一步分析发现AS160提高了胰岛β细胞的增殖能力。随后我们在体外培养的大鼠胰岛瘤细胞系INS-1中探讨AS160对胰岛β细胞增殖的调控，发现干扰AS160表达，导致细胞增殖缓慢，细胞周期阻滞，凋亡细胞比例增加。恢复表达AS160后，细胞增殖、周期和凋亡恢复到正常水平，说明AS160参与调节胰岛β细胞增殖。另外干扰AS160表达导致细胞糖摄取降低，细胞内腺苷三磷酸(Adenosine triphosphate, ATP)生成减少，表明AS160表达降低导致细胞能量供应不足，提示细胞能量供应不足是AS160下调导致细胞增殖变慢的原因之一。随后研究发现AS160可调节胰岛β细胞葡萄糖转运体2 (Glucose transporter 2, GLUT2)表达及其在细胞膜上的分布。过表达GLUT2可以恢复AS160下调引起的表型（增殖抑制、周期阻滞、ATP产生减少等），说明GLUT2介导AS160调控的胰岛β细胞增殖。同时AS160通过影响细胞内Ca2+离子水平进而调节钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶 (Calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinase, CaMKK)的活化。在ATP和Ca2+离子的共同作用下，AMP依赖的蛋白激酶(Adenosine 5‘-monophosphate (AMP)-activated protein kinase, AMPK)活性发生改变，引起雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin, mTOR)信号通路活性变化，导致下游与细胞周期及凋亡相关的蛋白表达异常，从而调控细胞增殖。综上所述，胰岛β细胞中的AS160与糖尿病的发生发展有密切联系，过表达AS160可保护STZ导致的胰岛β细胞损伤。进一步分析发现AS160通过ATP/Ca2+-AMPK-mTOR信号通路调节胰岛β细胞增殖从而影响其功能。本部分研究结果拓展了AS160的生物学功能，为AS160作为糖尿病靶点研究提供了理论依据。第二部分新型靶向葡萄糖转运体高通量药物筛选模型的建立与应用葡萄糖是维持细胞能量代谢和生命活动不可或缺的重要原料。细胞摄取葡萄糖, 必须由细胞膜上的葡萄糖转运蛋白协助完成。因此，葡萄糖转运蛋白是调控细胞糖代谢的第一道关卡。葡萄糖转运蛋白有两类：易化型葡萄糖转运蛋白 (facilitated glucose transporters, GLUTs)和Na+依赖型葡萄糖转运蛋白(sodium dependent glucose transporters, SGLTs)。GLUT蛋白是组织中分布最广、行使功能最多的葡萄糖转运蛋白，其中GLUT4是脂肪细胞和肌细胞内最主要的葡萄糖转运蛋白，胰岛素调控的GLUT4膜转运对于机体血糖平衡的维持至关重要。因此研究GLUT4功能及其膜转运机制并且寻找促进GLUT4转运的化合物对于糖尿病的发病机理研究以及潜在药物的发现都具有重要意义。SGLT蛋白主要分布在肾脏，SGLT2是肾脏最主要的葡萄糖转运体，负责90%左右的葡萄糖的重新吸收，在肾脏重吸收葡萄糖的过程中发挥重要作用，选择性抑制SGLT2可以增加尿糖排泄从而降低血糖。SGLT2近年来被认为是降糖药物开发中最具潜力的靶点之一。本部分针对GLUT4和SGLT2两个葡萄糖转运蛋白，分别建立了新型葡萄糖摄取的药物筛选模型，以期高效、简便、快捷的筛选靶向GLUT4和SGLT2的小分子，为抗糖尿病药物或先导化合物的发现提供更好的技术平台。目前研究GLUT4膜转运的主要方法是通过免疫荧光标记定量，但是这种方法耗时长并且无法实时监测GLUT4囊泡转运过程。很多研究者认为用免疫荧光方法得到的GLUT4转运效率远远低于实际的效率，因此目前急需切实有效、可靠性高且可以实时观察GLUT4转运的技术。我们利用pHluorin蛋白pH敏感的特性，建立了活细胞实时观察分析GLUT4囊泡膜转运、融合的双荧光探针pHluorin-GLUT4-mOrange2。我们首先通过免疫荧光、糖摄取、NH4Cl和胰岛素刺激等方法验证pHluorin-GLUT4-mOrange2探针具有GLUT4正常生物学功能，然后利用该探针简便准确地分析了PI3K和AKT在GLUT4囊泡转运融合过程中发挥的作用。同时通过定量分析pHluorin和mOrange2的荧光比值，计算GLUT4上膜率，将pHluorin-GLUT4-mOrange2用于胰岛素增敏剂的高通量筛选，并成功筛选出2个促进GLUT4膜转运的天然化合物小分子。这一方法大大降低了筛选成本，缩短筛选周期，为进一步发现靶向GLUT4膜转运的药物提供良好的技术平台。针对SGLT2靶点，我们建立了一种非放射性的体外SGLT2抑制剂筛选模型。首先利用带荧光基团的葡萄糖类似物2-Deoxy-2- [(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]-D-glucose (2-NBDG)作为指示剂，检测永生化的人肾近曲小管上皮细胞(Human kidney 2, HK-2)的葡萄糖摄取情况。我们将2-NBDG分别加入到含Na+和不含Na+的KRB (Krebs Ringer Buffer)缓冲液中，其中不含Na+的缓冲液是由GLUT2介导的2-NBDG摄取，而含Na+的缓冲液是由SGLT2和GLUT2二者共同介导的2-NBDG摄取，由二者的差值计算出SGLT2介导的2-NBDG摄取量。通过优化HK-2细胞代数、饥饿时间、2-NBDG孵育时间和浓度，我们确定了采用12代以内的HK-2细胞、200 μM 2-NBDG孵育60 min、不饥饿细胞为最佳实验条件。同时通过达格列净和根皮苷抑制实验确证了我们构建的筛选模型可以用于SGLT2抑制剂的筛选，且操作简便快捷，无污染，利于观察分析。其最大的优势是通过配合荧光显微镜技术，可以达到分析单个活细胞的荧光值，分析灵敏度更高，结果更精确。
	2019-06
学位授予单位	中国科学院昆明植物研究所
学位名称	博士
文献类型	学位论文
条目标识符	http://ir.kib.ac.cn/handle/151853/74014
专题	昆明植物所硕博研究生毕业学位论文
推荐引用方式 GB/T 7714	逯艳婷. AS160保护胰岛的功能研究及葡萄糖转运体筛选模型的建立[D]. 中国科学院昆明植物研究所,2019.

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逯艳婷-毕业论文.pdf（5442KB）	学位论文		限制开放	CC BY-NC-ND	请求全文