KIB OpenIR  > 昆明植物所硕博研究生毕业学位论文
秀丽隐杆线虫多磷酸肌醇激酶IPMK-1功能研究
杨钟林
Thesis Advisor罗怀容
Degree Discipline药理学
Keyword秀丽隐杆线虫 IPMK 衰老 发育 肌醇5-磷酸酶
Abstract肌醇磷酸(IP)充当信号传导信号来调节各种细胞过程,例如细胞生长。肌醇多磷酸多激酶(IPMK)产生肌醇四和五磷酸酯(IP 4和IP 5),作为肌醇多磷酸盐生物合成的关键酶。IPMK最初被发现是芽殖酵母中精氨酸感应转录复合物的必需亚基。在哺乳动物中,IPMK也被确认为生理上重要的磷脂酰肌醇3激酶(PI3K),其形成磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸酯(PIP 3),其激活Akt / PKB并刺激其信号传导。IPMK还可以以非催化方式起作用,非催化靶标包括细胞核中的细胞溶质信号因子和转录因子。IPMK涉及多种生理过程,解决它们各自的功能是非常具有挑战性的。大多数关于IPMK及其产物的研究是在哺乳动物细胞中进行的,很少有研究使用简单的多细胞体秀丽隐杆线虫。IPMK在从酵母、秀丽线虫到哺乳动物和人类等物种中高度保守。因此我们利用模式生物秀丽线虫研究IPMK的生理功能。通过NCBI蛋白序列的同源性分析,秀丽线虫ipmk-1与人类IPMK( NP_689416.1 ) 的蛋白序列相似度为30 %,与果蝇D. melanogaster IPK2 ( NP_608535.1 ) 的蛋白序列相似度为29 %, 与拟南芥A. thaliana IPK2β ( OAO95438.1 ) 的蛋白序列相似度为25 %, 与酵母S. arboricola ARG82p ( EHN03095.1 ) 的蛋白序列相似度为25 %同源。虽然蛋白序列相似度鉴定不算高,但秀丽线虫ipmk-1包含重要的功能结构域以及已知酶活性结构域中的重要残基是高度保守的。为了研究ipmk-1在线虫中的生理功能,我们从日本National BioResource Project购买了线虫株ipmk-1(tm2687)。ipmk-1突变体tm2687缺失190bp,缺失片段造成重要结构域阅读框的破坏,是功能严重缺失的突变体。ipmk-1突变株发育迟缓。当培养至48小时后,野生型N2已发育至成虫,而ipmk-1突变株尚处于幼虫L2和L3期。在25℃培养时,ipmk-1突变株在培养90小时后依然处于L3期,而且肠腔扩大,肠道细胞萎缩,生殖系统发育停滞。ipmk-1突变株产卵数量和孵化率低,在产卵后期出现卵在体内孵化现象,且生殖孔有明显的突起,通过rhodamine-phalloidin染色性肌肉F-actin后发现,ipmk-1突变线虫部分vms没有被rhodamine-phalloidin染色,vm1s和vm2s比野生型分离严重。说明突变株的产卵器官(egg-laying apparatus)发育缺陷。ipmk-1突变株寿命短,且使主要延长秀丽线虫寿命的信号如胰岛素信号通路daf-2 (e1370),、生殖信号通路glp-1 (e2144)、节食信号通路eat-2 (ad1116)和线粒体呼吸链信号通路clk-1 (e2519)的长寿突变株寿命缩短。尼罗红和油红O染色结果显示ipmk-1突变株脂肪含量少,同时直径大于3μm的脂滴比例显著大于野生型线虫。此外,ipmk-1突变体中甘油三酯(TAG)含量与总重量比从野生型的50%下降到35%。脂肪酸荧光标记染料BODIPY-C12结果表明ipmk-1突变株肠道吸收缺陷。基因检测结果显示参与脂肪水解,β氧化的基因上调。脂肪吸收减少和脂肪代谢增加可能是导致ipmk-1突变株脂肪含量减少的原因。构建含IPMK-1::GFP融合蛋白表达载体,转入秀丽线虫表达,观察到ipmk-1在头部神经元、咽泵、排泄管细胞和生殖体细胞中表达。在肠道和排泄细胞组织特异性表达野生型IPMK-1可以完全挽救ipmk-1突变缺陷表型,无催化活性的IPMK-1不能挽救ipmk-1突变缺陷表型。用EMS诱变tm2687获得可以抑制ipmk-1缺陷表型的突变株luo63。经与tm2687杂交后代分析得出luo63为隐性单基因突变。利用突变线虫MT464和MT465将luo63突变基因定位到X染色体。全基因组测序及PCR扩增测序验证分析后确定X染色体上C09B8.1 的第二个外显子上发生G-C突变,导致第66个精氨酸突变为脯氨酸。C09B8.1被预测编码I型肌醇5-磷酸酶同源物(ipp-5),将IP3脱磷酸化为IP2。通过ipp-5 RNAi 验证了ipp-5的缺失突变可以挽救ipmk-1缺陷。野生型IPP-5的回复挽救验证了ipp-5抑制ipmk-1缺陷的相关性。外源性补充高浓度的CaCl2可以部分挽救ipmk-1的发育缓慢和肠道降解。我们推测秀丽线虫IPMK-1与IPP-5协同调控细胞内Ca2+水平,调控下游细胞事件。秀丽隐杆线虫的IPMK-1生理作用及其潜在的功能机制有助于了解IPMK在其他物种,特别是哺乳动物中的作用,有助于进一步研究IPMK所涉及的疾病。
2019-06
Degree Grantor中国科学院昆明植物研究所
Degree Name博士
Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.kib.ac.cn/handle/151853/73990
Collection昆明植物所硕博研究生毕业学位论文
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GB/T 7714
杨钟林. 秀丽隐杆线虫多磷酸肌醇激酶IPMK-1功能研究[D]. 中国科学院昆明植物研究所,2019.
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