NaWRKY3在野生烟草抵御链格孢菌中的作用机制研究

	NaWRKY3在野生烟草抵御链格孢菌中的作用机制研究
	张书婷
导师	吴劲松
学位专业	生物化学与分子生物学
关键词	NaWRKY3 scopoletin scopolin 乙烯茉莉酸
摘要	WRKY是植物特有的一类转录因子，在植物生长发育及响应外界胁迫等生理生化过程中起着重要作用。野生烟草（Nicotiana attenuata）在受到链格孢菌（Alternaria alternata）侵染后，会激活茉莉酸（jasmonic acid, JA）和乙烯（ethylene, ET）信号，上调植保素scopoletin和scopolin来抵御该菌的入侵。前期研究结果表明，NaWRKY3是控制植保素scopoletin和scopolin的关键转录因子，但是具体的调控机制未知。本文以野生烟草和链格孢菌互作体系为研究对象，综合利用分子生物学和生物化学分析的手段，研究了NaWRKY3转录因子调控野生烟草基于植保素scopoletin和scopolin的分子机制。得出如下主要结论：1. NaWRKY3直接调控scopoletin和scopolin合成关键酶基因feruloyl-CoA 6’-hydroxylase 1 (NaF6’H1)的转录。本文首先验证了前期的结果，即链格孢菌诱导的植保素scopoletin和scopolin的合成及其关键合成酶基因NaF6’H1的表达在NaWRKY3沉默的植株中极显著下降。其次，凝胶迁移实验（EMSA）表明，带His标签的NaWRKY3蛋白（His-NaWRKY3）可以和NaF6’H1启动子上的两个W-box（T/CTGACT/C）直接结合。最后，烟草原生质体转录激活实验表明NaWRKY3的超表达可以略微激活NaF6’H1启动子的转录活性。从这些结果可以得出NaWRKY3非常可能在一些未知的辅因子的帮助下，通过直接作用于NaF6’H1的启动子调控植保素的合成。2. NaWRKY3调控链格孢菌诱导的乙烯和茉莉酸的合成。气相色谱和质谱联用法（GC-MS）检测到链格孢菌诱导的乙烯水平在NaWRKY3沉默的植物中显著降低。EMSA进一步证明His-NaWRKY3蛋白可以分别和植物激素乙烯的关键合成酶基因NaACS1及NaACO1启动子上的两个W-box结合。烟草原生质体转录激活实验表明NaWRKY3可以激活NaACS1及NaACO1启动子驱动的LUC基因的转录，即NaWRKY3通过激活NaACS1及NaACO1的转录直接调控乙烯的合成。同时，我们利用高效液相色谱和质谱联用法（LC-MS）还检测到链格孢菌诱导的茉莉酸及茉莉酸-异亮氨酸（JA-Ile）水平在NaWRKY3沉默的植株中显著降低，茉莉酸关键合成酶基因NaLOX3的转录水平也显著下降，说明NaWRKY3可能也通过NaLOX3调控了链格孢菌诱导的茉莉酸的合成。3. 在下一步将NaWRKY3通过基因工程转入栽培烟草前，明确了野生型植株作为阴性对照可以替代转化了空载体的植株。通过实时荧光定量PCR（q-PCR），在野生型的栽培烟草、转化了含有GUS基因空载体的植株以及转化了来自三七的DS基因（作为阳性对照）的植株中检测GUS与DS基因的表达水平，并比较了野生型与转化了空载体植株的发育表型。结果表明：转化了空载体的5个独立的植株除了具有高水平的GUS基因表达之外，其生长发育与野生型植株一致。这个结果提示野生型植株作为阴性对照可以替代转化了空载体的植株。综上，通过本研究，初步明确了NaWRKY3转录因子在野生烟草抵御链格孢菌中的作用机制：一方面，NaWRKY3通过直接作用于植保素scopoletin和scopolin的关键合成酶NaF6’H1，调控该植保素的合成；另一方面，NaWRKY3还调控植物激素乙烯与茉莉酸的合成，通过乙烯和茉莉酸信号途径进一步影响scopoletin的生物合成。本文的研究结果还提示：在今后NaWRKY3的基因工程应用中，野生型植株可以作为阴性对照替代转化了空载体的植株。
	2019-06
学位授予单位	中国科学院昆明植物研究所
学位名称	硕士
文献类型	学位论文
条目标识符	http://ir.kib.ac.cn/handle/151853/73980
专题	昆明植物所硕博研究生毕业学位论文
推荐引用方式 GB/T 7714	张书婷. NaWRKY3在野生烟草抵御链格孢菌中的作用机制研究[D]. 中国科学院昆明植物研究所,2019.

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