运用重组酶催化技术鉴定香茶菜细胞色素P450氧化酶的功能

	运用重组酶催化技术鉴定香茶菜细胞色素P450氧化酶的功能
	邵雪
导师	曾英
学位专业	药学
关键词	重组酶 P450氧化酶 P450还原酶对映-贝壳杉烯二萜毛萼香茶菜
摘要	植物可产生成千上万种不同的二萜化合物，这些二萜化合物可作为药物、香料、树脂和其他工业生物制品造福人类。生成二萜类化合物的氧化酶部分来自细胞色素P450氧化酶家族，其催化活性大多以酵母或大肠杆菌为宿主进行异源表达而得到鉴定。大肠杆菌不仅易于操作、成本低，且不含P450系统，因此无宿主P450干扰，在大肠杆菌中表达鉴定植物P450氧化酶已有不少成功范例。唇形科香茶菜属（Isodon）植物具有抗菌、消炎和祛无名肿毒之功效，是我国民间广泛使用的药草。对映-贝壳杉烷型二萜是唇形科香茶菜属（Isodon）植物抗菌抗肿瘤的核心组分，毛萼香茶菜（Isodon eriocalyx）相应的二萜合酶已由本课题组阐明，但二萜骨架后修饰尤其是对映-贝壳杉烯（ent-kaurene）首步氧化的酶学机制尚属未知。因此，本研究以大肠杆菌作为宿主进行毛萼香茶菜P450氧化酶（IeP450）及还原酶（IeCPR）基因的异源表达，采用粗酶催化对映-贝壳杉烯反应体系，通过GC-MS及LC-MS鉴定催化产物，以期发现催化对映-贝壳杉烯发生氧化反应的对映-贝壳杉烯氧化酶，为解析香茶菜对映-贝壳杉烷型二萜生物合成的酶分子机制奠定基础。主要研究结果如下：（1）根据毛萼香茶菜转录组及RNA数字表达谱测序，设计特异引物进行RT-PCR及RACE-PCR，克隆得到9条IeP450和1条IeCPR基因的全长序列。（2）异源表达：将本实验室前期获得的两个P450基因IeKO1和IeKO2与本研究获得的10条基因在大肠杆菌中进行异源表达，用pET-32a(+)分别构建了全长、去除N-端信号肽、以及N-端修饰（去除N-端信号肽另加“MAKKTSSKGK”10个氨基酸）的表达载体，共获得36个不同的表达菌株。通过优化IPTG浓度、诱导培养温度、时间及培养基等，实现了IeCPR的可溶表达及部分IeP450的少量可溶表达。（3）酶活鉴定：通过还原型细胞色素C (reduced cytochrome C) 在550 nm光吸收值的变化，采用粗酶和原生质体反应体系鉴定了IeCPR的电子传递活性。将IeCPR分别与不同的IeP450保温，以对映-贝壳杉烯为底物，用GC-MS和LC-MS检测预测产物，但均未发现可能的产物或其他新的化合物。综上所述，本研究从毛萼香茶菜中克隆得到9条IeP450和1条IeCPR基因的全长序列，尝试通过大肠杆菌进行异源表达与酶活鉴定。通过对每条基因信号肽的处理构建了三种不同的表达载体，连同IeKO1和IeKO2，共获得36个不同的表达菌株，通过优化培养实现了IeCPR的可溶表达及部分IeP450的少量可溶表达。以细胞色素C为底物，鉴定了IeCPR的电子传递活性。以对映-贝壳杉烯为底物，未检测到预测产物。一直以来，P450酶催化活性鉴定都是天然产物生物合成研究的难点，后续考虑将IeP450与IeCPR共表达进行异源表达与酶活鉴定。
	2019-06
学位授予单位	中国科学院昆明植物研究所
学位名称	硕士
文献类型	学位论文
条目标识符	http://ir.kib.ac.cn/handle/151853/73974
专题	昆明植物所硕博研究生毕业学位论文
推荐引用方式 GB/T 7714	邵雪. 运用重组酶催化技术鉴定香茶菜细胞色素P450氧化酶的功能[D]. 中国科学院昆明植物研究所,2019.

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终版-2016E8010663060+邵（3146KB）	学位论文		限制开放	CC BY-NC-ND	请求全文