乳突果组培苗中脂氧合酶基因的诱导及克隆

	乳突果组培苗中脂氧合酶基因的诱导及克隆
其他题名	Inducement and Clone of Lipoxygenase Gene from Cultural Seedlings of Adelostemma gracillimum
	李靖
导师	沈月毛
学位专业	植物学
关键词	脂氧合酶乳突果几丁质 Cdna克隆云南美登木水杨酸多羟基脂肪酸杜仲抗真菌蛋白
摘要	本论文分三部分，第一部分为综述。通过查阅文献详述了当前植物脂氧合酶的研究进展，包括植物脂氧合酶基因的表达调控、高等植物中脂氧合酶途径的生化研究进展、脂氧合酶初产物的色谱分析，并展望了植物脂氧合酶的研究趋势。第二部分为乳突果组培苗中脂氧合酶基因的诱导及克隆。脂氧合酶是植物十八碳酸途径中一个很重要的酶，该酶作用的产物在植物的生长发育过程中以及在植物对环境胁迫反应中起着重要的作用。先前，我们从乳突果愈伤组织中分离了两个三羟基十八碳烯酸，经分析MS和NMR波谱数据分别鉴定为9，12，13-三羟基-10-十八碳烯酸和9，10，11-三羟基-12-十八碳烯酸，它们具有相同的分子式和分子量（m/z330），而在LC-ESI-MS实验中准分子离子峰m／z 353［M十Na］+的保留时间分别为7和10min，从结构推断它们为脂氧合酶途径的产物。目前尚未见有关乳突果甚至萝摩科植物中脂氧合酶的研究报道。用几丁质对乳突果组培苗进行诱导，检侧氧脂含量，并分离脂氧合酶基因，可以探索几丁质诱导下的十八碳酸代谢途径，并为酶蛋白的分离及研究脂氧合酶的功能奠定基础。本论文用150 mg／L的几丁质对乳突果组培苗进行诱导，通过LC-ESI-MS测定几丁质诱导下悬浮培养系中三羟基十八碳烯酸的含量变化，发现加入几丁质12小时后，悬浮培养物中积累较高水平的9，10，11-三羟基-12-十八碳烯酸，该水平持续到诱导后24小时。粗酶活性鉴定结果显示，该酶可催化亚油酸酷生成9，10，11-三羟基-12-十八碳烯酸。根据诱导数据结合文献资料，对用几丁质诱导6小时的乳突果苗进行总RNA的提取，根据从植物中己克隆到的脂氧合酶基因的保守区合成引物，用RT-PCR技术克隆得到约600 bp脂氧合酶基因片段并测序。从总RNA中纯化出mRNA，通过RACE-PCR的方法得到脂氧合酶全长cDNA序列。该序列是一个新的植物脂氧合酶基因序列，在萝摩科植物中属于首次报道。根据序列分析结果，该酶和烟草的LOX具有最高的氨基酸同源性（72％），其次是土豆（70％），核苷酸序列同源性最高的分别是番茄（79％）和烟草（78％），它们都属于茄科植物。根据氨基酸序列分析结果，该蛋白分子量为98.0kD，pI为5.94，该酶在氨基酸581～582位置含有TV保守区，该区决定了产物的特异性，该酶具有9-LOX活性。第三部分为硕士期间其它两方面的工作：（1）水杨酸诱导美登木悬浮细胞产生脂氧合酶及多羟基脂肪酸的研究。水杨酸（SA）诱导云南美登木。（Maytenushookeri）悬浮培养细胞产生9-LOX，该酶可催化亚油酸生成9，12，13-三羟基-10-十八碳烯酸。通过Lc-ESI-MS测定SA诱导下悬浮培养系中多羟基脂肪酸的含量变化，发现用浓度为800协molfL的sA诱导培养18小时，悬浮细胞产生最大量的三羟基十八碳烯酸。同时，通过对比不同羟基十八碳烯酸含量的变化，发现在SA诱导下，9-Lox介导的十八碳酸途径中有环氧中间体的生成。（2）杜仲抗真菌蛋白（EAFP）时空表达特性的研究。通过分离纯化杜仲抗真菌蛋白来监测该蛋白在杜仲中的部位分布（皮、叶、根）和不同时间的分布。同时利用平板抑菌实验来检测杜仲抗真菌蛋白的抗菌活性。实验结果显示，杜仲抗真菌蛋白主要分布在树皮中，根中分布较少，而在叶中未被检测到。而且该蛋白的分布较为稳定，不随生长周期而改变。
语种	中文
	2004
学位授予单位	中国科学院昆明植物研究所
文献类型	学位论文
条目标识符	http://ir.kib.ac.cn/handle/151853/738
专题	昆明植物所硕博研究生毕业学位论文
推荐引用方式 GB/T 7714	李靖. 乳突果组培苗中脂氧合酶基因的诱导及克隆[D]. 中国科学院昆明植物研究所. 中国科学院昆明植物研究所,2004.

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