兜兰属植物离体繁殖和系统学研究

	兜兰属植物离体繁殖和系统学研究
其他题名	Studies on in vitro Propagation and Phylogenetics of Paphiopedilum
	龙波
导师	龙春林
学位专业	植物学
关键词	兰科:兜兰属:离体繁殖:离体花粉萌发:离体保存:系统学:Its:Rapd
摘要	全世界兜兰属（Paphiopedilum）植物总数为85种，中国是世界上兜兰属植物种类最丰富的国家之一，占了全世界的1/3，共29种。由于兜兰属中许多种类具有很高的观赏价值，导致资源破坏十分严重，一些种类已濒临灭绝。2004年出版的《中国物种红色名录》第一卷里，18种兜兰属植物中有5种被列为极危种，12种被列为濒危种。早在1997年制定的《华盛顿公约》（即《濒危野生动植物种国际贸易公约》，Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora，简称为CITES），所有兜兰被列入附录I，属于绝对禁止国际贸易的物种。本文从蒴果成熟度、培养基无机盐浓度和有机添加物、激素浓度入手，来探讨对兜兰属植物离体繁殖的最佳途径；研究兜兰花粉的寿命，外源的钙和硼对兜兰花粉萌发的影响；通过对兜兰属离体保存技术的研究，探索兜兰属植物离保存技术的最佳手段和方法，制定兜兰属植物保存规范；从形态学、分子生物学方面对兜兰属的系统学进行初步研究，对其亚属和组的划分、种间关系以及一些种的归属问题进行探讨。主要研究结果如下： 1. 中国兜兰属植物离体繁殖技术的研究对20种兜兰属植物进行离体繁殖技术的研究。以密毛兜兰为代表，实验结果证实了种子成熟度、培养基、碳源、天然添加剂对密毛兜兰种子萌发、原球茎和植株生长有明显影响：120 d、130 d、140 d种子不能萌发；随着种子每推迟10 d成熟,种子萌发率随之提高；200 d的种子达到萌发最高点；在KC培养基接种40 d达到最高萌发率，而VW培养基的原球茎直径最长；葡萄糖有利于种子萌发和叶的生长，其次是蔗糖、麦芽糖和甘露醇；10%椰子汁是最好的种子萌发天然添加剂，而土豆泥、苹果泥有利于叶的生长，相对差的是佛手瓜泥和LH。以密毛兜兰、巨瓣兜兰、波瓣兜兰、杏黄兜兰为例，证明了激素浓度对兜兰的芽繁殖率有显著影响：密毛、波瓣兜兰在BA 5.0 mg l-1 + NAA 0.5 mg l-1，BA 1 mg l-1 + NAA 0.5 mg l-1水平能达到增殖率100%；BA 5.5 mg l-1 + NAA 0.5 mg l-1 组合能使巨瓣兜兰达到增殖率为33%；每种激素水平都能使杏黄兜兰得到增殖，最高增殖率发生在BA 4 mg l-1 + NAA 0.1 mg l-1为200% (2.0芽/节间)。通过我们的实验方法，同样地成功离体繁殖和保存了另外15种兜兰属植物，以及1个自主杂交品种♀P. delicatum × ♂P. coccineum：卷萼兜兰、硬叶兜兰、巨瓣兜兰、同色兜兰、紫毛兜兰、紫纹兜兰、白花兜兰、长瓣兜兰、带叶兜兰、亨利兜兰、麻栗坡兜兰、包氏兜兰、浅斑兜兰、根茎兜兰、红旗兜兰。而且，在3个月内，1/4 MS medium + BA 2 mg + NAA 0.2 mg l-1, KT 2 mg + NAA 0.2 mg l-1分别使麻栗坡兜兰和长瓣兜兰增殖3倍和4倍。 2. 中国兜兰属植物的花粉离体萌发研究5种兜兰（格丽兜兰、波瓣兜兰、紫毛兜兰、长瓣兜兰、红旗兜兰）花粉的寿命，外源的钙和硼对兜兰花粉萌发的影响。在培养基缺糖、缺钙条件下，花粉都不萌发。虽然缺硼的培养基下，花粉仍会有极微量的萌发，但几乎可以忽略不计。在液体布氏培养基上，2个月、3个月成熟度的花粉依然可以萌发，与新鲜的20天的花粉萌发率没有多大区别。兜兰植物花粉管伸长需要的时间较长，一般要等到第4天、第5天。少数花粉在24小时以后才开始萌发，完全没有在24小时前萌发的花粉。所以在人工授粉后，五天内尽量不要浇水，以免柱头和花药聚集水分，导致霉菌容易生长，不利于花粉的萌发。 3. 兜兰属植物离体保存技术的研究在4 ℃保存兜兰幼苗，1个月以内取出复壮，恢复的状况比较好，超过1个月，植株就容易受到冻害。15 ℃的条件下，植株长势的缓慢，平均18个月继代1次，可以起到延缓继代周期的目的。通过对兜兰属15个种（含自主杂交品种1种）的离体保存技术的研究，我们制定了兜兰属植物离体保存规范。 4. 分子系统学研究基于ITS序列的数据对兜兰属70个种的研究，结合RAPD对于中国兜兰30个种的研究结果进行分析，支持唐沢耕司（1982）所提出的将兜兰属分为6个亚属的观点，其中产于中国的兜兰属植物可以划分为5个亚属：Sigmatopetalum、Paphiopedilum、Parvisepalum、Brachypetalum和Polyantha。①杏黄兜兰、硬叶兜兰、麻栗坡兜兰、白花兜兰和德氏兜兰为亚属Parvisepalum的成员；②长瓣兜兰和飘带兜兰所在的Pardalopetalum组升为亚属Polyantha；③同色兜兰、文山兜兰和巨瓣兜兰所在的Concolaria组升为亚属Brachypetalum；④Barbata组（即彩云兜兰、紫纹兜兰、胼胝兜兰、卷萼兜兰所在的组）升为亚属Sigmatopetalum；⑤Paphiopedilum亚属包括紫毛兜兰以及其变种包氏兜兰和密毛兜兰、根茎兜兰、波瓣兜兰、小叶兜兰和带叶兜兰等。 9个RAPD引物在中国兜兰属32个个体中总共扩增出产生99条可区分的DNA条带，根据种间的遗传相似系数和遗传距离的结果分析，巧花兜兰与海伦兜兰的遗传距离为0.3466，相似系数为0.7071。RAPD聚类图和ITS树状图显示，这两个种并没有聚成一支，而是远远的分开，并不是一个单系。因此，我们认为巧花兜兰不能并入海伦兜兰中，最多可以作为其变种处理，或者独立成种，隶属于兜兰亚属的Paphiopedilum兜兰组。与海伦兜兰同样，将文山兜兰归并到巨瓣兜兰或同色兜兰中，也是不合理的。RAPD遗传相似度表明：文山兜兰与同色兜兰的相似系数为0.2384，与巨瓣兜兰的为0.3324，亲缘关系较近。但不至于为同一个种。因此，不支持将文山兜兰并入巨瓣兜兰或者同色兜兰中，可以作为是其变种处理，隶属于Concoloria组。海伦兜兰、根茎兜兰和陈莲兜兰在亚属等级的归并还没有文献报道，在我们基于ITS序列的邻接树和严格一致树以及RAPD聚类图的结果，这几个种都嵌套在兜兰亚属的分支中，因此我们支持将这些种划分入兜兰亚属。
语种	中文
	2009-05-20
学位授予单位	中国科学院昆明植物研究所
文献类型	学位论文
条目标识符	http://ir.kib.ac.cn/handle/151853/476
专题	昆明植物所硕博研究生毕业学位论文
推荐引用方式 GB/T 7714	龙波. 兜兰属植物离体繁殖和系统学研究[D]. 昆明植物研究所. 中国科学院昆明植物研究所,2009.

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